Name: the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye
Uploaded: 2014-08-16T17:00:00
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私たちは、グラフィックの仕事のためにクリスティン·ジョンソンに感謝します。

動物に関わるすべてのプロトコルはに提示され、承認施設内動物管理使用委員会によって小児病院ボストンで、かつ実験動物管理の評価と認定協会（AAALAC）の勧告に従って行われているされている。手順の実行中、滅菌機器および無菌techniqureを使用してください。 ペレットの調製<ol><li>スクラルファート10mgのおよび滅菌曲がっていないスパチュラでハイドロン60mgの秤?...

<ol>
	<li>Gospodarowicz, D., Moran, J., Braun, D., Birdwell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+growth+of+bovine+vascular+endothelial+cells:+fibroblast+growth+factor+as+a+survival+agent.">Clonal growth of bovine vascular endothelial cells: fibroblast growth factor as a survival agent.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 4120-4124 (1976).</li><li>Glaser, B. M., D'Amore, P. A., Seppa, H., Seppa, S., Schiffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+tissues+contain+chemoattractants+for+vascular+endothelial+cells.">Adult tissues contain chemoattractants for vascular endothelial cells.</a> Nature. 288, 483-484 (1980).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. 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Exp. Med. 136, 261-276 (1972).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Leapman, S. B., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+growth+and+neovascularization:+an+experimental+model+using+the+rabbit+cornea.">Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea.</a> J. Natl. Cancer Inst. 52, 413-427 (1974).</li><li>Rohan, R. M., Fernandez, A., Udagawa, T., Yuan, J., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+heterogeneity+of+angiogenesis+in+mice.">Genetic heterogeneity of angiogenesis in mice.</a> FASEB J. 14 (7), 871-876 (2000).</li><li>Chang, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+response+of+FGF-2+for+lymphangiogenesis.">Dose-dependent response of FGF-2 for lymphangiogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (32), 11658-11663 (2004).</li><li>Udagawa, T., Birsner, A. E., Wood, M., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+suppression+of+angiogenesis+following+radiation+exposure+is+independent+of+hematopoietic+reconstitution.">Chronic suppression of angiogenesis following radiation exposure is independent of hematopoietic reconstitution.</a> Cancer Res. 67 (5), 2040-2045 (2007).</li><li>Turner, P. V., Albassam, M. 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成功した角膜アッセイを行うにはいくつかの重要なステップがあります。最初は、移植することが可能な均一なペレットを製造し、血管を刺激している。ペレット製剤の最も重要な部分は、1）無担体増殖因子を使用している。 2）エッペンドルフチュー​​ブからのペレットがキャストされたメッシュに迅速にしかし慎重に最終混合物を移動する）スクラルファートとハイドロンと3で、成長...

血管新生のプロセスは、新たな血管の形成は、既存のものを形成し、非常に複雑であり、血管の出芽および形態の異なるステップを制御するいくつかの内因性因子によって調節される。血管新生に起因プロと抗血管新生因子のバランスのずれ、通常は休止状態にある血管系を維持してバランスをトリガされます。成人における血管新生は、そのような女性の卵巣周期中のように、あるいは創傷治癒および組織再生などの修復過程における特定の生理学的条件で発生します。しかし、それはまた、悪性腫瘍、自己免疫状態および炎症性疾患を含むいくつかの病態の特徴である。これらの生理学的および病理学的状態における血管新生の関与は、それの研究と治療のための魅力的な標的のための重要な課題となります。 血管新生の複雑さと、いくつかのCEの関与のために細胞および間質細胞の循環内皮細胞、周皮細胞、を含むプロセスでLLSおよび因子は、in vitroモデルは、限定されるもので残り、 生体内微小環境に固有のを再現することはできません。血管新生の主要なインビトロアッセイは、主に内皮細胞に直接影響を観察し、制御された条件下で血管新生過程の特定のステップを測定することに焦点を当てている。これらのアッセイは、in vitroでのものとは異なり、 エクスビボモデル。内皮細胞増殖1の定量化、遊走2、ネットワーク形成3、管形成4及びスフェロイド5からの発芽を含む、より複雑であり、多数の組織の細胞型を組み込んで、例がある大動脈輪アッセイ6。それにもかかわらず、他のシステムと同様に、循環細胞の寄与およびin vivoで存在する内皮細胞の自然な間質をキャプチャすることはできません。試みずっと改善したものの、マイクロ流体システム7、しかしでもこれらのアッセイを使用して実行されるin vivoでの設定を模倣する流れの下の血管形成を研究するために、まだ、生体内に存在するすべての区画を占めることができない。 ためのin vitroおよび ex vivo血管新生モデルの制限のためのin vivoモデルは、血管新生研究のためのより信頼性の高い選択肢を残る。これらのモデルの例としては、顕微鏡8下で成長する血管の可視化を可能にする透明なチャンバー、「窓」の移植、例えばマウス耳およびニワトリ漿尿膜（CAMなどの正常組織におけるマトリゲル及び血管形成のような注射可能な皮下移植を含む）。しかし、最も許容され、定量的なin vivoでの血管新生モデルの一つは、当然無血管悪用ここで説明した角膜マイクロポケット血管新生アッセイは、ある新しい血管新生増殖9を視覚化し、評価するための「スクリーン」として角膜。 マウスで開発されたようにここでは、角膜マイクロポケットアッセイを記述する。最初に、モデルは、ウサギ角膜における非特異的な血管新生刺激を測定した。これは、ウサギの眼の前房の房水に腫瘍断片を導入することによって行われ、腫瘍誘導性新生血管11を測定した。 しかし、このアッセイは、後でより良い指定血管新生効果を標準化するために、特定の成長の影響を研究するために10因子発生した。目に増殖因子を放出するために、血管新生増殖因子の既知量を含有する徐放性ペレットは、代わりに組織を使用した。そのようなbFGFまたはVEGFなどの精製された組換え血管新生タンパク質の利用可能性は、血管新生modulaters 12の具体的な目標としてのそれらの使用を可能にした。最初に、このアッセイであった主にそのサイズのためにで動作するように容易になりますが、後でモデルをマウスに翻訳されたウサギ、で使用される;小型で安価な動物モデル。マウスにウサギからシフトすることにより、血管新生13に影響を与える遺伝的構成要素の研究の新たな領域を作成し、遺伝子操作した動物を使用することができるという重要な利点を提供した。血管新生の研究に角膜アッセイのより許容使用量に加えて、他の生物学的プロセスはまた、改変されたアッセイを用いて研究されてことができる。例えば、リンパ管新生の研究は、特定の分子マーカー14を通ってリンパ管の可視化を可能にした低用量のbFGFペレットの注入により可能となった。さらに、このアッセイは、血管形成15に対する放射線の影響を評価する手段を提供している。 要約すると、角膜マイクロ血管新生アッセイは、定量的、担当者であるin vivoでの血管新生のroducible、柔軟な評価。このアッセイの主な利点は、血管が自然に無血管組織に成長するので、背景血管の測定が不要であることである。私たちは詳細に、ここでこのアッセイのプロトコルを説明し、発生する可能性がありますさまざまなシナリオについて説明します。アッセイは3別個のセグメントで構成されています。ここでは、成長因子の包括的なペレットの調製、その後の外科的移植、最終的に得られた新生血管の成長を定量化するために使用される方法について説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Section 1: Pellet preparation</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucralfate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#S0652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydron (aka Poly(2-Hema))</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">#P3932-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:111px;">Pharmco Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">#111000200CSGL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Growth factors:</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA))</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;Fibroblast growth factor (FGF)</td>
			<td style="width:111px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">#AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vascular endothelial growth factor (VEGF)</td>
			<td style="width:111px;">R &#38; D Systems</td>
			<td style="width:119px;">#293-VE-050/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm dish</td>
			<td style="width:111px;">Becton-Dickson</td>
			<td style="width:119px;">#353001</td>
			<td>Used for storage of pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:111px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">#25384-342</td>
			<td>Used as work surface for preparing pellets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mesh</td>
			<td style="width:111px;">Sefar America</td>
			<td style="width:119px;">#03--300/51</td>
			<td>300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spatulas</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#21-401-10</td>
			<td>Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#05-408-146</td>
			<td>One for hydron, one for sucralfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2315E</td>
			<td>Need 2 for pulling mesh apart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal evaporator</td>
			<td style="width:111px;">ThermoSavant</td>
			<td style="width:119px;">DNA110 SpeedVac</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 2: Surgical implantation of pellets</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Operating microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5%</td>
			<td style="width:111px;">Falcon</td>
			<td>NDC# 6131401601</td>
			<td>Eye anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment</td>
			<td style="width:111px;">Bausch &#38; Lomb</td>
			<td style="width:119px;">NDC# 2420878055</td>
			<td>Contains neomycin, polymixin and bacitracin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ophthalmic microknife, 5 mm</td>
			<td style="width:111px;">Surgistar</td>
			<td style="width:119px;">#924501</td>
			<td>30 degree angle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">von Graef knife</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#3401E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #1</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2301E</td>
			<td>Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Jewelers forceps, #5</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#2305E</td>
			<td>For picking up pellets and placing on eye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Small curved scissors</td>
			<td style="width:111px;">Ambler Surgical</td>
			<td style="width:119px;">#5636E</td>
			<td>For trimming whiskers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gauze</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For blotting eye after proparacaine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Section 3: Grading of Corneal Neovascularization</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2.5% Avertin</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>General anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Slit lamp</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">FS-2</td>
			<td>Needs an ocular with a reticule to assist in measuring</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the corneal micropocket assay: a model of angiogenesis in the mouse eye

マウス角膜マイクロポケットアッセイは、血管形成を評価するための堅牢かつ定量的なin vivoアッセイである。自然に無血管の角膜を通して血管増殖を誘発特定の成長因子を含む標準化された徐放性ペレットを使用することにより、血管新生を測定し、定量することができる。このアッセイにおいて血管新生反応は、使用される成長因子の種類と用量に応じて、数日間にわたって生成される。血管新生の誘導は、一般的に塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）または血管内皮増殖因子（VEGF）のいずれかによってトリガされる。スクラルファートとヒドロン（ポリ-HEMA（ポリ（2 - ヒドロキシエチルメタクリレート）））これらの成長因子を組み合わせて、ペレットに混合物をキャストすることによって、それらは外科的にマウスの眼に埋め込むことができる。これらの均一なペレットは、血管領域Qに必要な十分な血管新生応答を可能にする（それぞれ、bFGFまたはVEGF）五、六日間の成長因子をゆっくりと放しスリットランプを用いてuantification。このアッセイは、血管形成モジュレーター薬または治療、ならびに血管新生に影響を及ぼす異なる遺伝的背景との比較評価を含む異なる用途に使用することができる。この検定の練習後に熟練した研究者は、眼あたり5分未満でペレットを移植することができます。

通常の低血管新生C57BL / 6JマウスにおけるbFGFおよびVEGFペレットのための典型的な結果は、それぞれ、 図2A及びBに示されている。 図2Eは、これらの成長の変化用量のC57BL / 6J株における血管面積（VA）の正規分布を示して要因。 1.8〜2.4ミリメートル2の範囲内の値が許容されるものの80 ngのbFGFをペレットは、通常、約2.0ミリメートル2のVAにな...

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The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

プロトコルは、マウスにおいて開発された角膜マイクロポケットアッセイを説明しています。

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

網膜色素上皮の全マウントするためのマウスの眼の解剖

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Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

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Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

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A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

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テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

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