Name: bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00
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Wir bedanken uns für die Bereitstellung FortéBio Grafiken in Abbildung 1 verwendet. Diese Arbeit wurde vom NIH GM083088 TMD unterstützt

<html> 1. Programmierung des Instruments für BLI-Test Schalten Sie das Gerät mindestens eine Stunde im Voraus, um die Lampe zum Aufwärmen, das ist notwendig, um das Rauschen zu minimieren und Drift in der optischen Signal während des Experiments. Stellen Sie die gewünschte Temperatur über die Registerkarte Instrument, um die Probe Plattenhalter vorwärmen. Dann das experimentelle Design in der Datenerfassung-Software. Wählen Sie &quot;Neu Kinetics Experiment&quot; in der Registerkarte As...

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Die derzeit verfügbaren Instrumente zur BLI ermöglichen signifikante Durchsatz und Flexibilität in Tests zur biomolekularen Wechselwirkungen. Verschiedene Lösungsproben werden in die Vertiefungen einer schwarzen Mikrotiterplatte abgegeben wird, und einen Satz von parallelen BLI Sensoren programmiert werden, um zwischen den Spalten der Vertiefungen auf der Platte hin und her zu bewegen. Die Proben werden durch Orbitalschütteln während des Tests gerührt. Das hier verwendete System 8 Sensoren und verwendet eine 96-w...

Protein-Protein-Wechselwirkungen sind wichtig für viele biologische Prozesse und markierungsfreie optische Methoden wie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden in vitro verwendet worden, um die Kinetik der Bindung und Dissoziation 1 studieren. Die meisten markierungsfreien Methoden ein Biomolekül Immobilisierung auf einer Sensoroberfläche und verwenden Sie ein optisches Signal an einen Bindungspartner aus der Lösung zu erkennen, wie es mit dem immobilisierten Biomolekül 1 zuordnet. Während SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, ist es anfällig für Störungen aufgrund von Änderungen des Brechungsindex der Lösung über dem Sensor 2 fließt. Obwohl nicht so empfindlich wie SPR, Bio-Schicht-Interferometrie (BLI) weniger von Änderungen in der Probenzusammensetzung 1,3 betroffen. BLI verwendet LWL-Biosensoren, die eine proprietäre biokompatible Beschichtung an der Spitze zu haben. Das hier verwendete (Octet-RED96)-System enthält acht Spektralphotometer. Weißes Licht wird an einer Reihe von Sonden, die an einem Roboterarm bewegen geleitet. Faseroptische Sensoren are, aufgenommen durch die Sonden und in eine Platte mit 96 Vertiefungen enthaltenden Proben. Eines der Zielmoleküle auf der Biosensoroberfläche immobilisiert. Dann Sensoren werden in die Vertiefungen, die die Bindungspartner in der Lösung bewegt wird. BLI überwacht Verband der Bindungspartner immobilisiert mit dem Molekül und überwacht Dissoziation nach dem Umzug die Sensoren an-Lösung ohne den Bindungspartner dann. Bindung von Molekülen an die Biosensor-Oberfläche führt zu Änderungen der optischen Interferenz zwischen Lichtwellen, die von einer Innenfläche und von der externen Schnittstelle zwischen Sensor und zurück in die Lösung Spektralphotometer reflektieren. Diese Veränderungen in der Interferenz quantifiziert und zur kinetischen Raten der Bindung und Dissoziation, wie in der Animation der Figur 1 zusammengefaßt bestimmen. Wir haben BLI angelegt, um Wechselwirkungen zwischen dem katalytischen Komplex von bakteriellen ATP-Synthase und seine ε-Untereinheit, die das automatische hemmen das Enzym zu messen. ATP synthase ist eine membranständige Drehnanomotor, der Synthese und Hydrolyse von ATP katalysiert 4. Der katalytische Komplex (F 1) in einer löslichen Form, die als ATPase arbeitet isoliert werden. Ε-Untereinheit besitzt zwei Domänen: die N-terminale Domäne (NTD) ist die korrekte Montage und funktionelle Kopplung des Enzyms notwendige, aber nicht direkt interagieren mit den katalytischen Untereinheiten, der C-terminalen Domäne (CTD) kann das Enzym durch die Interaktion mit inhibieren mehrere katalytischen Untereinheiten 5,6. Diese ε-vermittelte Regulierung ist spezifisch für bakterielle ATP-Synthase und wird nicht in der mitochondrialen Homolog beobachtet. ATP-Synthase hat als Ziel für antibakterielle Medikamente entstanden, wie die jüngsten FDA-Zulassung von bedaquiline zu arzneimittelresistenten Tuberkulose zu behandeln 7 gezeigt. So Targeting ε die hemmende Rolle für die Wirkstoffforschung konnte die antibakterielle die mitochondriale ATP-Synthase nicht hemmen ergeben. Mit dem isolierten katalytischen Komplex (F 1), εwird zu einem dissoziierbares Untereinheit. Doch mit ε F 1 gebunden ist, der kann einen dramatischen εCTD Konformationsänderung unterziehen, teilweise in zentralen Hohlraum des Enzyms Einfügen und Bildung eines hemmenden Zustand, die wahrscheinlich nicht direkt 6,8 distanzieren ist. Wir verwenden BLI Kinetik der F 1 / ε-Bindung und Dissoziation zu messen, und indirekt an allosterische Effekte von katalytischen-Ort-Liganden auf die ε-Konformation zu untersuchen. In unserem System wurde ε für die Immobilisierung auf der Sensoroberfläche, da BLI-Signal (wie SPR) ausgewählt ist empfindlich gegenüber der Masse der Bindungsmoleküle an der Oberfläche. Die ε-Untereinheit ist klein (~ 15 kDa) gegenüber dem Haupt F 1-Komplex (~ 347 kDa). Somit wird eine größere BLI Signal aus der Bindung an immobilisiertes F 1 ε führen. Um F 1 Dissoziation, die sehr langsam sein kann überwachen, müssen ε stark immobilisiert werden. So entschieden wir uns für biotinylierenUnd Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten Biosensoren. Proteine ​​können durch (i) zufällige Modifikation der Oberfläche Lysine 9, (ii) Umsetzung einer einzigartigen nativen oder gentechnisch Cystein mit einem Biotin-Maleimid-Reagenz 10 oder (iii) Zugabe einer genetisch bestimmten Biotin-Akzeptor-Peptid, das enzymatisch biotinyliert wird während biotinyliert in vivo-Expression des markierten Proteins 11. In unserem System wird ε (iii) 8 unter Verwendung von Verfahren biotinyliert. Sobald Biotin-markierten ε auf Streptavidin immobilisiert Sensoren können BLI die Bindung und Dissoziation von F 1, die von ε-Untereinheit (F 1 (-ε)) abgereicherte messen. Für die hier beschriebenen Experimente war vorläufigen Tests durchgeführt, um angemessene Mengen des biotinylierten Proteins zu bestimmen, um auf die Sensoren zu immobilisieren. Dies kann variieren, abhängig von dem Molekulargewicht des Proteins und seinem Bindungspartner, aber das Ziel ist, eine minimale Menge an immobilisiertem Protein t bestimmenHat bietet (i) akzeptable Signal-zu-Rauschen für Bindungskinetik mit einer niedrigen Konzentration des Bindungspartners (nachfolgend K D) und (ii) minimale Verzerrung Bindungskinetik mit nahezu Sättigungskonzentration des Bindungspartners. Auch kann Stöchiometrie Biotinylierungsgrad variieren (aber vermeiden&gt; 1 Mol Biotin / Mol Protein), so dass einige erste Test kann für jede neue Charge von biotinyliertem Protein benötigt werden, um zu bestätigen, dass eine konsistente BLI-Signal kann während der Immobilisierung auf Streptavidin-beschichteten erreicht werden Sensoren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Wir beschreiben die Verwendung von Bio-Schicht Interferometrie inhibitorische Wechselwirkungen der ε-Untereinheit mit dem katalytischen Komplex von Escherichia coli ATP-Synthase zu studieren. Bakterielle F-ATP-Synthase ist das Ziel eines neuen, von der FDA zugelassene Antibiotikum zur Bekämpfung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Verständnis bakterienspezifischen Auto Hemmung der ATP-Synthase durch die C-terminale Domäne von ε-Untereinheit kann ein neues Mittel, um das Enzym für die Entdeckung der antibakterielle Medikamente an. Die C-terminale Domäne von ε erfährt eine dramatische Konformationsänderung, wenn das Enzym die Übergänge zwischen den aktiven und inaktiven Zuständen und katalytischen Ort Liganden beeinflussen, welche von Konformationen ε vorherrschende ist. Die Assay-Maßnahmen Kinetik der ε die Bindung / Dissoziation mit der katalytischen Komplex und indirekt mealeistet die Verschiebung des enzymgebundenen ε zu und von der scheinbar nondissociable inhibitorische Konformation. Die Bio-Schicht Interferometrie Signal nicht überempfindlich auf Lösungszusammensetzung, so kann es auch verwendet werden, um allosterische Effekte von katalytischen Ort Liganden auf Konformationsänderungen ε überwachen werden.

Echtzeit-Bindung und Dissoziation BLI Kinetik sind in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Experiment wurde mit Testpuffer in Assoziation und Dissoziation getan. Dieses Experiment wurde mit einer 10 min Basis Schritt gestartet, da die Sensoren erst kurz vorbefeuchtet worden. Als nächstes wurde biotinyliertes ε auf den Sensoren geladen. Keine nachweisbare Dissoziation von ε aufgetreten ganzen restlichen Schritte von der Referenzkurve (G), die keine Bindungspartner aufgenommen hatte gesehen. Eine zweite Ref...

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Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Die Protokolle beschreiben kinetische Untersuchungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Bio-Schicht-Interferometrie. F-ATP-Synthase, die in der zellulären Energiestoffwechsel beteiligt ist, kann durch die ε-Untereinheit in Bakterien gehemmt werden. Wir haben Bio-Schicht Interferometrie geeignet ist, Wechselwirkungen des katalytischen Komplexes mit inhibitorischer C-terminalen Domäne ε zu studieren.

Bio-Schicht-Interferometrie zur Messung der Kinetik der Protein-Protein-Interaktionen und allosterische Ligandeneffekte

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

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