Name: bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

אנו מודים FortéBio למתן גרפיקה המשמשת באיור 1. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM083088 לTMD

<html> 1. תכנות המכשיר לAssay BLI הפעל את המכשיר לפחות שעה אחת מראש כדי לאפשר את המנורה כדי להתחמם, זה הכרחי כדי למזער את הרעש ולהיסחף באותות אופטיים במהלך הניסוי. הגדר את הטמפרטורה הרצויה באמצעות כרטיסיית המכשיר לprewarm מדגם בעל הצלחת. ואז ל?...

<ol>
	<li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis.">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li><li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li><li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes.">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li><li>Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enzymes.">The Enzymes.</a> Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).</li><li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+subunit+&#949;+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase.">The role of subunit &#949; in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li><li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+(F1)+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation.">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li><li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+40+years,+new+medicine+for+combating+TB.">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li><li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F1-ATPase+of+Escherichia+coli:+The+&#1013;-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis,+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state,+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands.">F1-ATPase of Escherichia coli: The &#1013;-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li><li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor:+glycosylation,+trafficking,+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface.">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li><li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein.">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li><li>Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

מכשירים זמינים כעת עבור BLI לאפשר תפוקה משמעותית וגמישות במבחנים לאינטראקציות biomolecular. דגימות פתרון שונות הם ויתרו בבארות של צלחת microtiter שחורה, ומערכת של חיישני BLI מקבילים מתוכנתות לנוע קדימה ואחורה בין העמודים של בארות על הצלחת. הדגימות הם עוררו על ידי טלטול מסלולית לא...

אינטראקציות בין חלבונים חשובות לתהליכים ביולוגיים רבים, ושיטות אופטיות ללא תווית כמו Surface Plasmon תהודה (SPR) היו בשימוש במבחנה ללמוד קינטיקה של מחייב ודיסוציאציה 1. רוב השיטות ללא תווית לשתק biomolecule אחד על משטח חיישן ולהשתמש אות אופטי לאיתור שותף מחייב מפתרון כפי שהוא מקשר עם biomolecule המשותק 1. בעוד SPR הוא שיטה רגישה מאוד, הוא נוטה להפרעות כתוצאה משינויים במדד השבירה של הפתרון זורם על החיישן 2. למרות שלא רגיש כמו SPR, Bio-שכבת Interferometry (BLI) הוא פחות מושפע משינויים בהרכב מדגם 1,3. BLI משתמש biosensors סיבים האופטיים שיש להם ציפוי ביולוגית קניינית בקצה. המערכת משמשת כאן (שמינייה-RED96) מכילה שמונה הספקטרופוטומטרים. אור לבן מוזרם לשורה של בדיקות שתעבורנה על זרוע רובוטית. חיישנים אופטיים סיבי arדואר נאסף על ידי החלליות ועבר לצלחת 96 היטב המכילה דגימות. אחת ממולקולות המטרה הוא משותק על פני השטח biosensor. אז חיישנים מועברים לבארות המכילות שותף המחייב בתמיסה. BLI עוקב אחר קשר של השותף מחייב עם המולקולה המשותקת, ולאחר מכן עוקב אחר ניתוק לאחר שעבר את החיישנים לפתרון ללא שותף המחייב. הכריכה של מולקולות על פני השטח biosensor מובילה לשינויים בהפרעות אופטיות בין גלי אור המשקפים חזרה להספקטרופוטומטרים ממשטח פנימי ומתוך הממשק החיצוני בין החיישן ופתרון. שינויים אלה בהתערבות ניתן לכמת ומשמשים לקביעת שיעורים הקינטית של כריכה, דיסוציאציה, כפי שסוכם באנימציה של איור 1. יש לנו ליישם BLI למדוד אינטראקציות בין המתחם הקטליטית של ה-ATP synthase חיידקים ומקטע ε שלה, אשר יכול אוטומטית מעכב את האנזים. סאי ה-ATPnthase הוא nanomotor סיבובי מוטבע קרום שמזרז סינתזה והידרוליזה של 4-ATP. קומפלקס קטליטי (F 1) יכול להיות מבודד בצורה מסיסה שעובדת כATPase. יש ε המקטע שני תחומים: תחום N-המסוף (NTD) הוא דרוש להרכבה נכונה וצימוד תפקודי של האנזים, אך לא במגע ישיר עם יחידות משנה קטליטי; תחום בטרמינל C-(CTD) יכול לעכב את האנזים על ידי אינטראקציה עם יחידות משנה קטליטי מספר 5,6. רגולציה בתיווך ε זה היא ספציפית לsynthases ה-ATP בקטריאלי ואינו נצפתה בhomologue המיטוכונדריה. ה-ATP synthase התפתחה כמטרה לתרופות אנטיבקטריאליות, כפי שמוצג על ידי אישור ה-FDA לאחרונה bedaquiline לטיפול שבחפת עמידה לתרופות 7. לכן, מיקוד התפקיד המעכב של ε לגילוי סמים יכולים להניב antibacterials שלא לעכב את ה-ATP synthase המיטוכונדריה. עם המתחם המבודד קטליטי (F 1), εהופך למקטע קשור זה. עם זאת, עם ε חייב 1 F, εCTD יכול לעבור שינוי קונפורמציה דרמטי, החדרה באופן חלקי לתוך החלל המרכזי של האנזים ולהרכיב מדינה מעכבת שלא סביר לנתק ישירות 6,8. אנו משתמשים BLI למדוד קינטיקה של F 1 / ε מחייב ודיסוציאציה, ובעקיפין, על מנת לבחון אפקטי allosteric של קטליטי אתר ligands על קונפורמציה של ε. במערכת שלנו, ε נבחר לקיבוע על משטח החיישן מאז אות BLI (כמו SPR) הוא רגיש למסה של המולקולות מחייבות על פני השטח. מקטע ε הוא (~ 15 KDA) קטן יחסית למתחם העיקרי F 1 (~ 347 KDA). לפיכך, אות BLI גדולה יותר תגרום מכריכה של 1 F לε המשותק. על מנת לפקח דיסוציאציה F 1, אשר יכול להיות מאוד איטי, ε חייב להיות חזק משותק. לכן בחרנו biotinylate; ולשתק אותו על biosensors streptavidin מצופה. ניתן biotinylated חלבונים על ידי שינוי (i) אקראי של lysines פני השטח 9, (ii) תגובה של ציסטאין ילידים מהונדס או ייחודי עם מגיב ביוטין-maleimide 10 או (iii) גנטי הוספת הפפטיד יוטין-acceptor ספציפי שbiotinylated אנזימים במהלך בביטוי vivo של החלבון מתויג 11. במערכת שלנו, ε הוא biotinylated באמצעות שיטה (iii) 8. ברגע שε-מתויג ביוטין הוא משותק על חיישני streptavidin, BLI יכול למדוד את הכריכה וניתוק של 1 F כי כבר מדולדל של ε למקטע (F 1 (-ε)). לניסויים שתוארו כאן, מבחני ראשוניים שנעשו כדי לקבוע כמויות סבירות של חלבון biotinylated כדי לשתק בחיישנים. זה יכול להשתנות, בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון ושותף המחייב שלה, אבל המטרה היא לקבוע כמות מזערית של חלבון לא משותקיםכובע מספק (i) מקובל אות לרעש לכריכת קינטיקה עם ריכוז נמוך של שותף המחייב (להלן K D) וכן (ii) עיוות מינימאלית של כריכת קינטיקה עם ריכוז להרוות-קרוב של שותף המחייב. כמו כן, הרכב של biotinylation עשוי להשתנות (אך להימנע&gt; ביוטין / חלבון mol mol 1), ולכן חלק assay הראשוני עשוי להיות נחוץ לכל מנה חדשה של חלבון biotinylated כדי לאשר שאות BLI עקבית יכולה להיות מושגת בחוסר התנועה בstreptavidin מצופה חיישנים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

אנו מתארים את השימוש בInterferometry Bio-השכבה ללמוד אינטראקציות מעכבות של ε למקטע עם מורכב הקטליטית של ה-ATP synthase Escherichia coli. ה-ATP synthase F-סוג חיידקים הוא היעד של אנטיביוטיקה חדשה, שאושרה על ידי ה-FDA כדי להילחם שבחפת עמידה לתרופות. הבנת חיידקים ספציפיים אוטומטי עיכוב של ה-ATP synthase ידי תחום בטרמינל C-של ε למקטע יכול לספק אמצעי חדש כדי למקד את האנזים לגילוי של תרופות אנטי בקטריאליים. תחום בטרמינל C-של ε עובר שינוי קונפורמציה דרמטי כאשר מעברי האנזים בין המדינות פעילות ולא פעילים, וligands קטליטי האתר יכולים להשפיע על איזה מהתצורות של ε הוא דומיננטי. צעדי assay קינטיקה של מחייב / הניתוק של ε עם מורכב קטליטי, ובעקיפין מאהsures המשמרת של ε בכריכת האנזים ומקונפורמציה המעכבת nondissociable כנראה. אות Interferometry Bio-השכבה אינה רגישה יתר על המידה להרכב פתרון, כך גם ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר השפעות allosteric של ligands קטליטי האתר על שינויי קונפורמציה של ε.

זמן אמת מחייב וקינטיקה BLI הניתוק מוצגות באיור 3. ניסוי זה נעשה עם חיץ assay בעמותה ודיסוציאציה. ניסוי זה החל בצעד בסיסי 10 דקות מאז החיישנים היו prewet רק לזמן קצר. בשלב בא, ε biotinylated הועמס על החיישנים. אין ניתוק לגילוי של ε התרחש לאורך כל השלבים הנותרים כפי שניתן לראות...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

הפרוטוקולים כאן לתאר מבחני הקינטית של חלבונים אינטראקציות עם Interferometry Bio-השכבה. ה-ATP synthase F-הסוג, שהוא מעורב בחילוף חומרים של אנרגיה בתאים, יכול להיות מעוכב על ידי מקטע ε בחיידקים. יש לנו להתאים Interferometry Bio-שכבה כדי לחקור אינטראקציות של קומפלקס קטליטי עם התחום בטרמינל C-המעכב של ε.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

פשוט ומהיר פרוטוקול למדידת שומנים ניטרלי בתאי אצות באמצעות הקרינה

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

בחינה כמותית ואיכותי של אינטראקציות חלקיקי חלקיקים באמצעות קולואיד Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

מבוסס ELISA כריכה ותחרות שיטה במהירות לקבוע אינטראקציות ליגנד לרצפטור

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

סינתזה של חלקיקים CDS-חינם ליגנד בתוך מטריקס קופולימר גופרית

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

תיוג ספין בימוי אתר ולימודי ספקטרוסקופיות EPR של pentameric ליגנד מגודרת יון ערוצים

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

ההפרדה סולפט ידי סלקטיבי התגבשות עם ליגנד Bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

תובנה לתוך האינטראקציות של חומצות אמינו פפטידים עם חומרים אורגניים באמצעות ספקטרוסקופיית חיל מולקולה בודדת

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

גישה וליובל ליגנד עומדי מתכות מעבר: הכנת סולם שונה, ביניים של 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

התגרענות בתיווך ליגנד והצמיחה של חלקיקי מתכת פלדיום

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...