Name: bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

Vi takker FortéBio for å tilveiebringe grafikk som brukes i figur 1. Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend GM083088 til TMD

<html> En. Programmere Instrument for BLI analysen Slå på instrumentet i minst en time på forhånd for å tillate lampen å varmes opp, og dette er nødvendig for å redusere støy og drift i optiske signalet i løpet av eksperimentet. Still inn ønsket temperatur via fanen instrument å prewarm prøven plate holder. Deretter setter du opp eksperimentell design i Data Acquisition programvare. Velg &quot;New Kinetics Experiment&quot; i kategorien Veiviser Experiment. Dette utgjør et fanebase...

<ol>
	<li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis.">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li><li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li><li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes.">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li><li>Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enzymes.">The Enzymes.</a> Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).</li><li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+subunit+&#949;+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase.">The role of subunit &#949; in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li><li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+(F1)+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation.">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li><li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+40+years,+new+medicine+for+combating+TB.">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li><li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F1-ATPase+of+Escherichia+coli:+The+&#1013;-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis,+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state,+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands.">F1-ATPase of Escherichia coli: The &#1013;-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li><li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor:+glycosylation,+trafficking,+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface.">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li><li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein.">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li><li>Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

For tiden tilgjengelige instrumenter for BLI tillate betydelig gjennomstrømming og fleksibilitet i analyser for biomolekylære interaksjoner. Forskjellige prøver løsning blir dispensert i brønner på en sort mikrotiterplate, og et sett med parallelle BLI sensorer er programmert til å bevege seg frem og tilbake mellom kolonner av brønner på platen. Prøvene ble omrørt med kretsende rysting i løpet av analysen. Systemet som er brukt her har 8 sensorer og bruker en 96-brønners prøveplate, men et annet system ben...

Protein-protein-interaksjoner er viktige for mange biologiske prosesser, og merke-fri optiske metoder som overflate-plasmonresonans (SPR) har blitt brukt in vitro for å studere kinetikken til bindings og dissosiasjon 1.. De fleste etikettfrie metoder immobilisere en biomolekyl på en sensorflate og bruke et optisk signal for å påvise en bindingspartner fra oppløsning som den forbinder med den immobiliserte biomolekyl 1.. Mens SPR er en meget følsom metode, er den utsatt for forstyrrelser på grunn av endringer i brytningsindeksen til oppløsningen strømmer over sensoren 2.. Selv om ikke så følsom som SPR, Bio-lags interferometri (BLI) er mindre påvirket av endringer i utvalgssammensetningen 1,3. BLI bruker fiberoptiske biosensorer som har en proprietær biocompatible belegg på spissen. Systemet brukes her (Oktett-RED96) inneholder åtte spektrofotometre. Hvitt lys transporteres i rørledning til en rad av sonder som beveger seg på en robotarm. Fiberoptiske sensorer are plukket opp av probene, og flyttet til en 96-brønners plate inneholdende prøver. En av målmolekylene er immobilisert på biosensor overflate. Da sensorene er flyttet til brønner inneholdende bindingspartneren i løsning. BLI overvåker sammenslutning av bindingen partner med immobilisert molekylet, og overvåker dissosiasjon etter flytting sensorene til løsning uten binding partner da. Binding av molekyler på biosensor overflate fører til endringer i optisk interferens mellom lysbølger som reflekterer tilbake til spek fra en innvendig overflate og fra den ytre grenseflaten mellom sensoren og løsning. Disse forandringene i interferens kan kvantifiseres og brukt til å bestemme kinetiske rater binding og dissosiasjon, som oppsummert i animasjonen på figur 1. Vi har søkt BLI å måle interaksjonen mellom det katalytiske kompleks av bakteriell ATP syntase og dens ε subenhet, noe som kan auto-hemme enzymet. ATP synthase er et membran-forankret roterende nanomotor som katalyserer syntese og hydrolyse av ATP 4.. Det katalytiske kompleks (F 1) kan isoleres i en oppløselig form som virker som en ATPase. Subenheten ε har to domener: N-terminal domene (NTD) er nødvendig for riktig montering og funksjonell kopling av enzymet, men ikke kommuniserer direkte med de katalytiske underenhetene, den C-terminale domene (CTD) kan hemme enzymet ved å samhandle med flere katalytiske subenheter 5,6. Dette ε-mediert regulering er spesifikke for bakterielle ATP synthases og er ikke observert i det mitokondrielle homologue. ATP syntase har dukket opp som et mål for antibakterielle legemidler, som vist ved siste FDA godkjenning av bedaquiline å behandle multiresistent tuberkulose 7. Dermed rettet ε er hemmende rolle for medisiner kan gi antibakterielle midler som ikke hemmer mitokondrie ATP syntase. Med den isolerte katalytiske kompleks (F 1), εblir en dissosierbare subenhet. Men med ε bundet til F 1, kan εCTD gjennomgå en dramatisk konformasjonsforandringer, delvis settes inn i enzymet sentrale hulrom og som danner en hemmende tilstand som er lite sannsynlig å dissosiere direkte 6,8. Vi bruker BLI for å måle kinetikken F 1 / ε binding og dissosiasjon, og indirekte, for å undersøke allosteriske effekter av katalytisk stedet ligander på ε sin konformasjon. I vårt system, ε ble valgt for immobilisering på følerens overflate, siden BLI signal (som SPR) er følsom overfor massen til molekylene som bindes på overflaten. Den ε subenheten er små (~ 15 kD) i forhold til hoved F 1 kompleks (~ 347 kDa). Således vil en større BLI signal skyldes binding av F-1 til immobilisert ε. For å overvåke F 1 dissosiasjon, noe som kan være svært langsom, må ε være sterkt immobilisert. Derfor valgte vi å biotinylere; Og immobilisere den på streptavidin-belagt biosensorer. Proteiner kan bli biotinylert ved å (i) tilfeldig modifisering av overflate lysines 9, (ii) omsetning av en unik opprinnelig konstruert eller cystein med en biotin-maleimid reagens 10 eller (iii) å legge en genetisk bestemt biotin-akseptor peptid som er enzymatisk biotinylert løpet in vivo-ekspresjon av den kodede protein 11. I vårt system, er ε bitinylert bruker metoden (iii) 8. Når biotin-merket ε immobiliseres på streptavidin-sensorer, kan BLI måle binding og dissosiasjon av F 1 som har blitt tømt for subenheten ε (F 1 (-ε)). For de eksperimenter som er beskrevet her, har foreløpige tester blitt utført for å bestemme rimelige mengder av det biotinylerte protein for å immobilisere på sensorene. Dette kan variere avhengig av molekylvekten av proteinet og dets bindingspartner, men målet er å bestemme en minimal mengde av immobilisert protein that gir (i) akseptabelt signal-til-støy-for bindingskinetikker med en lav konsentrasjon av bindingspartner (nedenfor K D) og (ii) minimal forvrengning av bindingskinetikker med nær metning konsentrasjon av bindingspartneren. Også støkiometri av biotinylering kan variere (men unngå&gt; 1 mol biotin / mol protein), slik at noen innledende analysen kan være nødvendig for hvert nytt parti av biotinylert protein for å bekrefte at en konsistent BLI signal kan bli oppnådd ved immobilisering på streptavidin-belagte sensorer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Vi beskriver bruk av Bio-lags Interferometry å studere inhiberende interaksjoner av subenheten ε med det katalytiske kompleks av Escherichia coli ATP syntase. Bakteriell F-type ATP synthase er målet for en ny, FDA-godkjente antibiotika for å bekjempe multiresistent tuberkulose. Forstå bakterier-spesifikke auto-hemming av ATP syntase av C-terminal domenet av subenheten ε kunne gi en ny måte å målrette enzymet for oppdagelsen av antibakterielle legemidler. Det C-terminale domenet av ε undergår en dramatisk konformasjonsforandringer når enzym overganger mellom de aktive og inaktive tilstander, og katalytisk-site ligander kan påvirke hvilket ε er konformasjonen er dominerende. Den analysen måler kinetikken for ε sin binding / dissosiasjon med det katalytiske kompleks, og indirekte meaSures forskyvning av enzym-bundet ε til og fra tilsynelatende nondissociable hemmende konformasjon. The Bio-lags Interferometry signalet ikke er altfor følsomme for løsning sammensetning, slik at den også kan brukes til å overvåke allosteriske effekter av katalytisk-site ligander på ε største konformasjonsendringer.

Sanntids bindings og dissosiasjon BLI kinetikken er vist i figur 3.. Dette forsøk ble gjort med forsøksbuffer sammen og dissosiasjon. Dette forsøk ble startet med en 10 min baseline trinn siden sensorene hadde blitt prewet kun i kort tid. Deretter ble bitinylert ε lastet på sensorene. Ingen påvisbar dissosiasjon av ε oppstod gjennom alle de gjenværende trinn sett fra referansekurven (G), som ikke hadde noen bindende partner tilsatt. Et andre referansesensor (H) var blottet for immobilisert prote...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Protokollene her beskriver kinetiske analyser av protein-protein interaksjoner med Bio-lags interferometri. F-type ATP syntetase, som er involvert i cellulær energi-metabolisme, kan inhiberes ved sin ε subenheten i bakterier. Vi har tilpasset Bio-lags interferometri for å studere interaksjoner av det katalytiske kompleks med ε sin hemmende C-terminale domenet.

Bio-lags interferometri for måling Kinetics av ​​Protein-protein interaksjoner og Allosterisk Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

En enkel og rask protokoll for måling av nøytrale lipider i algecellene med fluoresens

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Kvantitativ og kvalitativ undersøkelse av Partikkel-partikkel interaksjoner ved hjelp av kolloidalt Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

En ELISA binde- og konkurranse Metode for å raskt bestemme ligand-reseptor interaksjoner

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Syntese av ligand-fri CdS Nanopartikler i en Svovel Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Side Regissert Spin Merking og EPJ spektroskopiske studier av penta Ligand ionekanaler

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

Sulfat Separasjon ved Selektiv Krystallisering med en Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Innsikt i de Samhandling av aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Bruke Single-Molecule Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

Tilgang Valuable Ligand Støtter for Transition Metals: En modifisert, Intermediate Scale Utarbeidelse av 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Ligand-mediert Nucleation og vekst av Palladium metall nanopartikler

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Bio-lags interferometri for måling Kinetics av ​​Protein-protein interaksjoner og Allosterisk Ligand Effects

Bio-lags interferometri for måling Kinetics av Protein-protein interaksjoner og Allosterisk Ligand Effects