Name: bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

Agradecemos ForteBio para proporcionar gráficos utilizados en la Figura 1. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención GM083088 a TMD

<html> 1. Programación del Instrumento de Ensayo BLI Encienda el instrumento por lo menos una hora de antelación para que la lámpara se caliente, lo que es necesario para minimizar el ruido y la deriva de la señal óptica durante el experimento. Ajuste la temperatura deseada a través de la pestaña instrumento para precalentar el soporte de la placa de la muestra. Entonces pongo el diseño experimental en el software de adquisición de datos. Seleccione &quot;Experimento Nueva Cinética&qu...

<ol>
	<li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis.">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li><li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors.">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li><li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes.">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li><li>Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Enzymes.">The Enzymes.</a> Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).</li><li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+subunit+&#949;+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase.">The role of subunit &#949; in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li><li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+(F1)+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation.">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li><li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+40+years,+new+medicine+for+combating+TB.">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li><li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F1-ATPase+of+Escherichia+coli:+The+&#1013;-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis,+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state,+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands.">F1-ATPase of Escherichia coli: The &#1013;-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li><li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor:+glycosylation,+trafficking,+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface.">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li><li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein.">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li><li>Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

Instrumentos disponibles en la actualidad para BLI permiten el rendimiento y una flexibilidad significativa en los ensayos para las interacciones biomoleculares. Varias muestras de solución se dispensan en los pocillos de una placa de microtitulación de negro, y un conjunto de sensores de BLI paralelas están programadas para moverse adelante y atrás entre las columnas de pozos en la placa. Las muestras se agitan por agitación orbital durante todo el ensayo. El sistema utilizado aquí tiene 8 sensores y utiliza una ...

Interacciones proteína-proteína son importantes para muchos procesos biológicos, y los métodos ópticos de etiqueta libre como resonancia de plasmón superficial (SPR) se han utilizado in vitro para estudiar la cinética de la unión y la disociación 1. La mayoría de los métodos de etiquetado libre inmovilizar una biomolécula en una superficie del sensor y el uso de una señal óptica para detectar una pareja de unión de la solución, ya que se asocia con la biomolécula inmovilizada 1. Mientras SPR es un método altamente sensible, es propenso a la interferencia debido a los cambios en el índice de refracción de la solución que fluye sobre el sensor 2. Aunque no es tan sensible como la SPR, Bio-capa de Interferometría (BLI) se ve menos afectada por cambios en la composición de la muestra 1,3. BLI utiliza biosensores de fibra óptica que tienen un recubrimiento biocompatible patentada en la punta. El sistema utilizado aquí (Octeto-RED96) contiene ocho espectrofotómetros. La luz blanca se canaliza a una fila de sondas que se mueven en un brazo robótico. Los sensores de fibra óptica are recogido por las sondas y se trasladó a una placa de 96 pocillos que contenía las muestras. Una de las moléculas diana se inmoviliza sobre la superficie del biosensor. Entonces sensores se mueven a los pocillos que contienen la pareja de unión en solución. BLI supervisa asociación de la pareja de unión con la molécula inmovilizada y, a continuación, controla la disociación después de mover los sensores a la solución sin la pareja de unión. La unión de moléculas a la superficie del biosensor conduce a cambios en la interferencia óptica entre las ondas de luz que reflejan de nuevo a los espectrofotómetros de una superficie interna y desde la interfaz externa entre el sensor y la solución. Estos cambios en la interferencia pueden ser cuantificados y se utilizan para determinar las constantes de transferencia de la unión y la disociación, que se resumen en la animación de la figura 1. Hemos aplicado BLI para medir las interacciones entre el complejo catalítico de la ATP sintasa bacteriana y su subunidad ε, que puede auto-inhiben la enzima. Sy ATPnthase es un nanomotor rotatorio membrana embebido que cataliza la síntesis y la hidrólisis de ATP 4. El complejo catalítico (F 1) se puede aislar en una forma soluble que funciona como una ATPasa. Ε Subunidad tiene dos dominios: el dominio N-terminal (NTD) es necesario para el montaje correcto y el acoplamiento funcional de la enzima pero no interactuar directamente con las subunidades catalíticas, el dominio C-terminal (CTD) puede inhibir la enzima mediante la interacción con múltiples subunidades catalíticas 5,6. Esta regulación ε-mediada es específico de ATP sintasas bacterianas y no se observa en el homólogo mitocondrial. ATP sintasa se ​​ha convertido en un objetivo para los fármacos antibacterianos, como lo demuestra la reciente aprobación de la FDA de bedaquiline para tratar la tuberculosis resistente a los medicamentos 7. Por lo tanto, la orientación papel inhibidor de ε para el descubrimiento de fármacos podría producir antibacterianos que no inhiben la ATP sintasa mitocondrial. Con el complejo catalítico aislada (F 1), εse convierte en una subunidad disociable. Sin embargo, con ε unida a F 1, la εCTD puede sufrir un cambio conformacional dramática, parcialmente insertar en la cavidad central de la enzima y la formación de un estado de inhibición que es poco probable que se disocian directamente 6,8. Utilizamos BLI para medir la cinética de F 1 / ε de unión y de disociación, e indirectamente, para examinar los efectos alostéricos de sitio catalítico de ligandos sobre la conformación de ε. En nuestro sistema, ε fue elegido para la inmovilización en la superficie del sensor ya que la señal de BLI (como SPR) es sensible a la masa de las moléculas de unión en la superficie. La subunidad ε es pequeño (~ 15 kDa) en relación con el principal complejo de F 1 (~ 347 kDa). Por lo tanto, una señal de BLI más grande será el resultado de la unión de F 1 a ε inmovilizada. Con el fin de supervisar F 1 disociación, que puede ser muy lento, ε deben estar fuertemente inmovilizado. Por lo tanto se optó por biotinilar; E inmovilizarlo sobre biosensores recubiertas con estreptavidina. Las proteínas pueden ser biotinilados por (i) modificación aleatoria de lisinas superficiales 9, (ii) reacción de una cisteína nativo o de ingeniería único con un reactivo de maleimida-biotina 10 o (iii) añadir genéticamente un péptido específico de biotina-aceptor que está biotinilado durante enzimáticamente la expresión in vivo de la proteína marcada 11. En nuestro sistema, ε está biotinilado utilizando el método (iii) 8. Una vez ε-biotina marcado se inmoviliza sobre sensores de estreptavidina, BLI puede medir la unión y la disociación de F 1 que ha sido empobrecido de la subunidad ε (F 1 (-ε)). Para los experimentos descritos aquí, los ensayos preliminares se han realizado para determinar una cantidad razonable de la proteína biotinilada para inmovilizar en los sensores. Esto puede variar, dependiendo del peso molecular de la proteína y su pareja de unión, pero el objetivo es determinar una cantidad mínima de proteína A inmovilizada tsombrero proporciona (i) aceptable señal-a-ruido para la cinética de unión con una baja concentración de la pareja de unión (por debajo de K D) y (ii) una distorsión mínima de la cinética de unión con la concentración cerca de la saturación de la pareja de unión. También, estequiometría de biotinilación puede variar (pero evite&gt; 1 mol biotina / mol de proteína), por lo que puede ser necesario algún ensayo inicial para cada nuevo lote de proteína biotinilada para confirmar que una señal de BLI consistente se puede lograr durante la inmovilización en el recubiertas con estreptavidina sensores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Se describe el uso de la interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones inhibidoras de ε subunidad con el complejo catalítico de Escherichia coli ATP sintasa. Bacteriana de tipo F ATP sintasa es el objetivo de un nuevo antibiótico, aprobado por la FDA para combatir la tuberculosis resistente a los medicamentos. La comprensión de bacterias específicas auto-inhibición de la ATP sintasa por el dominio C-terminal de la subunidad ε podría proporcionar un nuevo medio para orientar la enzima para el descubrimiento de fármacos antibacterianos. El dominio C-terminal de ε sufre un cambio conformacional dramática cuando las transiciones de la enzima entre los estados activos e inactivos, y ligandos de sitio catalítico pueden influir en cuál de conformaciones de ε es predominante. El ensayo mide la cinética de unión / disociación de ε con el complejo catalítico, e indirectamente meaSures el cambio de ε unido a la enzima hacia y desde la conformación inhibidor aparentemente nondissociable. La señal de interferometría Bio-capa no es excesivamente sensible a la composición de la solución, por lo que también se puede utilizar para vigilar los efectos alostéricos de ligandos de sitio catalítico sobre los cambios conformacionales de ε.

De unión en tiempo real y la cinética de disociación BLI se muestra en la Figura 3. Este experimento se realizó con tampón de ensayo en asociación y disociación. Este experimento se inició con una etapa de línea de base 10 minutos ya que los sensores se han prehumedecido sólo brevemente. Siguiente, ε biotinilado se cargó en los sensores. No disociación detectable de ε se produjo a lo largo de todos los pasos restantes como se ve desde la curva de referencia (G), que no tenía pareja de uni...

Watch this Scientific Journal Video about Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects at JoVE.com

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Los protocolos siguientes describen ensayos cinéticos de las interacciones proteína-proteína con Interferometría Bio-capa. F-tipo ATP sintasa, que está implicado en el metabolismo de la energía celular, puede ser inhibida por su subunidad ε en bacterias. Hemos adaptado Interferometría Bio-capa para estudiar las interacciones del complejo catalítico con el dominio del ε inhibidora C-terminal.

Interferometría Bio-capa para Cinética de interacciones proteína-proteína y alostéricos Efectos ligando medición

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Investigación

Química

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

El examen cuantitativo y cualitativo de las interacciones entre partículas Uso coloidal Sonda Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

Un ELISA basado Encuadernación y método Competencia determinación rápida interacciones ligando-receptor

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Síntesis del ligando libre de CdS nanopartículas dentro de una matriz de copolímero de azufre

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Sitio Dirigida Etiquetado vuelta y EPR estudios espectroscópicos de Canales pentamérica por ligando de iones

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

La separación por cristalización selectiva sulfato con un ligando bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

El acceso a valiosa ligando Soportes para metales de transición: Una modificación, escala intermedia Preparación de 1,2,3,4,5-pentametilciclopentadieno

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

Mediada por el ligando de la nucleación y crecimiento de nanopartículas de Metal de paladio

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...