Name: an in vivo crosslinking approach to isolate protein complexes from drosophila embryos
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00
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우리는이 연구와 기술적 도움 요르단 데이비스, 야니 린, 에릭 샤 들러와 Jimiao 청 감사합니다. 이 작품은 ALA에 MCB-1054962에게 부여는 NSF 경력에 의해 지원되었다

1. 큰 사과 주스 한천 플레이트를 준비 <ol><li> 4 판을 만들려면, 1,000 ㎖의 플라스크에 375 ㎖의의 H 2 O, 12,375 g 플라이 한천 및 교반 막대를 추가합니다. 이 느슨하게 액체 제품에 대해 하나의 30 분 멸균 사이클에 덮인 플라스크의 뚜껑 믹스 A. 오토 클레이브 믹스입니다. </li><li> 500 ㎖ 비커에 125 ㎖의 사과 주스, 12.5 g 테이블 설탕 및 교반 막대를 추가합니다. 믹스의 고압 증기 멸균이 완료 될...

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	<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li><li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq.">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li><li>Sutherland, B. 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Genes &amp; development. 23, 2742-2752 (2009).</li><li>Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. 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A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+facets+interacts+with+vasa+in+the+Drosophila+pole+plasm+and+protects+it+from+degradation.">Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation.</a> Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).</li></ol>

포름 알데히드는 일반적으로 단백질 - 단백질 및 단백질 - 핵산 상호 작용을 식별하기위한 가교제로서 사용되고있다. 함께 하류 질량 분석 절차와 호환성과의 우수한 용해도 및 세포막 투과성은, 세포 내 가교 애플리케이션 3,15-17 알데히드 이상적인 후보 약제 만든다. 특히, 성공적 바사, 초파리 (11)에서 중요한 생식 세포 RNA 헬리 카제와 관련된 mRNA를 식별하는 데 사용되었?...

multisubunit 단백질 어셈블리 및 DNA 또는 RNA-단백질 복합체의 분리는 단백질 복합체, DNA-결합 규제 단백질이나 RNA 결합 단백질의 RNA의 대상으로 인식 게놈 유전자 좌를 식별하기 위해 수행된다. 다른 방법은 특정 RNA 결합 단백질 (CLIP-서열) 2와 관련된 전사 인자 또는 염색질 단백질 (칩 - 서열) 1 RNA의 대상으로 인식 DNA 사이트의 게놈 전체의 식별을 할 수 있습니다. RNA 유래의 cDNA 또는 DNA의 대상 라이브러리는 다음 깊이 순서가됩니다. 이러한 방법은 화학 물질 또는 UV-유도 공부 착체의 단백질 성분에 대한 항체로 면역 침전 (IP)이어서 복합체를 안정화하는 가교를 사용한다. 생물체의 개발 과정에서 많은 단백질 복합체가 일시적으로 형성한다. 따라서, 어플을 제어하는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 생체 내에서 이러한 복합체 조성물 및 기능을 분석하는 데있어 매우 중요elopment. 이 상호 작용하는 구성 요소와 체외에서 세포의 생화학 적 환경의 기본 농도를 재현하는 것은 사실상 불가능하기 때문에 이러한 생체 분석은 체외 방법이 뛰어난 것입니다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 Drosophila의 배아에서 큰 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 생체 내 접근 방식을 보여줍니다. 이 방법에서, 살아있는 배아 단백질 복합체는 저 알데히드 농도 및 후속 또한 단백질 복합체가 행 착체 및 질량 분광 분석의 겔 정제하여 착물의 알려진 성분에 대한 항체와 IP에 의해 절연되어 가교 아르 알 수없는 복잡한 구성 요소를 식별합니다. 포름 알데히드는 세포막을 투과 할 수 있으며, 2.3-2.7 3의 가교 범위를 가지고 있기 때문에, 단백질 복합체는 생체 내에서 가교 결합 될 수 있고, 복잡한 구성 요소는 서로에 근접 할 가능성이있다. 이 문서에 우리의예를 들어 튜더 (TUD) 단백질 복합체의 분리를 사용하여이 방법을 설명합니다. TUD는 생식 개발 4-7 필수적인 생식 단백질이다. 이 단백질은 다른 폴리 펩타이드 8-10의 메틸화 아르기닌 또는 라이신과 상호 작용하는 것으로 알려져 11 TUD 도메인이 포함되어 있습니다. 이전에, 우리는 기능 TUD 5 HA-태그를 표현하기 때문에, 특정 항-HA 항체 가교 후 TUD 단지를 아래로 당겨하는 데 사용되는 형질 전환 초파리 라인을 생성했다. 단백질 - 단백질 가교뿐만 아니라, 포름 알데히드는 핵산 - 단백질 가교를 생성 할 수 및 칩 SEQ 실험에 사용된다. 또한, 초파리, 포름 알데히드 가교 생체 내에서 바사 RNA 헬리 케이즈 단백질 (11)의 RNA 대상의 식별을 허용했다. 이 문서에서 우리는 생체 가교 PUR하는 방법을 설명하는 동안Drosophila의 배아에서 단백질 복합체의 ification,이 방법은 다른 생물과 조직에 적용 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Drosophila agar</td>
			<td style="width:235px;">Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td>
			<td style="width:119px;">FLY-8020-1</td>
			<td style="width:289px;">Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">H5501</td>
			<td style="width:289px;">Other name: TEGOSEPT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Population cage</td>
			<td style="width:235px;">Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td>
			<td style="width:119px;">59-104</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Fine nylon mesh</td>
			<td style="width:235px;">Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td>
			<td style="width:119px;">57-102</td>
			<td style="width:289px;">When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">D8938-1SET</td>
			<td style="width:289px;">Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td style="width:289px;">PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-HA agarose beads</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">The kit also includes HA-peptide and spin columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HA-peptide</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">Prepare to 2 mg/ml with PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spin Column</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">Spin columns are included as part of the kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP26324</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP151-500</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heptane</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">H350-4</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:235px;">Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td>
			<td style="width:119px;">AM9625</td>
			<td style="width:289px;">Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP531-500</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0724</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0301</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0730</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">P7626-1G</td>
			<td style="width:289px;">Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">I8896-50ML</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP337-100</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15-ml tubes</td>
			<td style="width:235px;">USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td>
			<td style="width:119px;">1475-0511</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:235px;">Clorox brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:289px;">Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50-ml tubes</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td>
			<td style="width:119px;">352098</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Top layer sieve</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">04-884-1AK</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bottom layer sieve</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">04-884-1BA</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo crosslinking approach to isolate protein complexes from drosophila embryos

많은 세포 과정은 multisubunit 단백질 복합체에 의해 제어된다. 자주하는이 단지는 일시적으로 형성하고 조립하는 네이티브 환경을 필요로합니다. 따라서, 이러한 기능성 단백질 복합체를 식별하기 위해서는 세포 용해 및 후속 정제 전의 생체들을 안정화시키는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 Drosophila의 배아에서 대형 선의의 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 용이하게 세포막을 통과 할 수 알데히드의 낮은 농도를 사용하여 생체 내 가교에 의해 배아 내부 복합체 배아 permeabilization과 안정화에 기초한다. 이어서, 관심의 단백질 복합체는 겔 정제하여 질량 분석계로 분석 immunopurified된다. 우리는 생식 개발을위한 필수적인 튜더 단백질 복합체의 정화를 사용하여이 방법을 보여줍니다. 작은 - 튜더 여러 튜더 도메인을 포함하는 큰 단백질이며,표적 단백질의 메틸화 아르기닌 또는 리신과 상호 작용 모듈. 이 방법은 다른 생물과 조직에서 네이티브 단백질 복합체의 분리를 위해 적용 할 수 있습니다.

웨스턴 블롯 하였다 (도 1에 도시) 7 % 단계 겔 (도 2) - 가교 결합의 효과와 가교 TUD 단백질 착물의 정제는 성공적으로 3 %의 SDS-PAGE로 분석 하였다. 3 %를 사용하는 목적 - 7 % 스텝 겔 착물 잔존 미가 교 TUD 단백질 농도에서 가교 TUD 단백질 복합체의 효과적인 분리를 기반으로한다. 상기 우리 생체 가교 조건 하에서, TUD 단백질의 큰 비율은 미가 교 ?...

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An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

생체</em에서 단백질 복합체를 분리> 가교 접근 초파리 태아

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

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In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Drosophila의 배아들 중에서 - 생체내의 원심 분리

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Upright Imaging of Drosophila Embryos

의 입식 이미징 Drosophila 태아

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

생체 가교 접근 초파리 태아

생체 가교 접근 초파리* 태아*