Name: long-term intravital immunofluorescence imaging of tissue matrix components with epifluorescence and two-photon microscopy
Uploaded: 2014-04-22T14:45:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy at JoVE.com

Авторы благодарны Джереми CM Тео и С. Райан Оливера за их вклад и Иоланта Kilarska за помощь в обработке изображений. Мы благодарим основной механизм BioP в EPFL за поддержку с двухфотонного микроскопии Эта работа была частично поддержана грантами Комиссии Европейского исследовательского (DC-лимфа, 206653-2), Европейской рамочной проекта 7 (AngioScaff), Швейцарского национального научного фонда (31-135756), и американского Национального института здоровья (NIH) / NIH сердца, легких и крови институт (NHLBI) (РВЫХ1 HL096539). Кроме того, средства от Роберта Wenner премии (Швейцарский Лиги Рак) разрешается покупка стереомикроскоп Leica использована в данном исследовании. Доноры не участвовал в разработке дизайна исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Все процедуры, проводимые на животных были в строгом соответствии с Законом о защите животных швейцарской, постановления о защите животных и Постановления об экспериментов на животных. Мы подтверждаем, что наш уход и использованию животных комитета Институциональная (IACUC), названный Комиссия де видеонаблюдения де l&#39;Etat-де-Во (разрешение номер: 2687), в частности, одобрил это исследование. 1. Прививки опухоли уха <ol><li> Культура B16-F10-GFP клетки меланомы в блюдо 10 см Петри с использованием DMEM + 10% FBS СМИ. </li><li> Когда клетки составляют 80-90% сливной, промойте их PBS и снять их трипсинизацией. Спин вниз клетки при 1500 х г в течение 5 мин при 4 ° С, ресуспендируют осадок в 1 мл раствора Рингера и передавать его в 1,5 мл пробирку Эппендорфа. Спин снова и удалить все супернатант кроме тонким слоем среды, которая остается только над осадком. Ресуспендируют клеток в конечном итоге с толстым клеток суспензии. </li><li> Обезболить мышь смесью кетамин / dorbene [медетомидин] (75mg/kg-1mg/kg) и убедитесь, что животное достаточно наркозом, выполняя нежный ног щепотку. Увеличение концентрации ИФ с шагом 0,1% в движениях случае наблюдаются (например вывод лапы). Держите мышь на прямой термистора контролируется грелку (37 ° C) в течение всей процедуры и защищать свои глаза с соответствующим глазной мази. </li><li> Подготовка шприца Гамильтона (33 G иглу, 10 мл шприц объем). Извлеките наконечник колпачок с иглы и загрузить 20 мкл клеточной суспензии в верхней части наконечника камеры. Потяните поршень до 5 мл суспензии не загружен внутри шприца. Удаление избытка суспензии из наконечника камеры и закрыть крышку наконечника. </li><li> Использование клейкой ленты, исправить проксимальный край уха на кончике указательного пальца. В углом 45 °, медленно вставьте иглу шприца Hamilton между спинной дермы и хряща. Оказавшись внутри, проникнуть в ухо проксимальнее дистальной течение 2-3 мм. <bоб /&gt; Примечание: Процедура инъекции клеток должно быть сделано обученным и сертифицированным специалистом. Кроме того, этот процесс должен быть выполнять медленно и в следующей последовательности: первый игла должны быть размещены горизонтально на кожу уха и вставить медленно в ухо дермы. Как только и только тогда конец иглы в кожу, поршень должна быть нажата. При нажатии плунжера будет инициировать клеток прививку в коже. В том маловероятном случае иглы, проходящей два слоя уха дермы, слоя хряща и проникает в кожу лица, выполняющего эксперимент, боль, причиненный экспериментатор пальцем следует рассматривать как тревожный знак и привести к немедленному опровержение иглы из кожи экспериментатор. В этом случае поршень не должна быть нажата и кожа должны быть стерилизованы с алкоголем. Кроме того, неодушевленный объект вместо пальца можно использовать для стабилизации ухо. </li><li> Введите суспензии 3 мкл клеток и медленно втянуть иглу из уха.Пусть опухолевые клетки образуют твердую опухоль в течение 7-9 дней и последующей рост опухоли с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. </li><li> Кроме того, следить за ранние этапы взаимодействия опухолевых клеток с матрицей ткани, применяется 50 мкл 100000 опухолевых клеток, взвешенных в растворе Рингера на открытых и окрашенных ушных дермы (после шага 3.3). </li></ol> 2. Ухо хирургии <ol><li> За три дня до эксперимента, брить голову мыши, удалять волосы волосы вокруг головы и уха (10-15 сек) и смыть водой. </li><li> Обезболить мышь смесью увлажненного кислорода и изофлураном (3-4% индукции, 1-2% техническое обслуживание) и убедитесь, что животное достаточно наркозом, выполняя нежный ног щепотку. Увеличение концентрации ИФ с шагом 0,1% в движениях случае наблюдаются (например вывод лапы). Держите мышь на прямой термистора контролируется грелку (37 ° C) в течение всей процедуры и защищать свои глазанеобходимости глазная мазь. </li><li> Постройте платформу, сделанную из 8 склеенных стекла гистологии слайдов. Переверните мышь на спину и осторожно положите опухолями уха на стопку стеклах. Используйте небольшие полоски клейкой ленты для фиксации передней и задней кромок уха в стек. </li><li> Разрежьте брюшной кожи уха вдоль противозавитка ушной раковины мыши с помощью скальпеля. С помощью изогнутых пинцетом, осторожно снимите брюшной дермы и хрящ от спинных дермы, где опухоль была привитых. Снять брюшной кожи и хрящей с изогнутыми щипцами, выставляя спинной дермы. Примечание: Если основные сосуды уха вырезаны или циркуляция крови не возвращается в нормальном потоке в течение 15 мин, ухо не может быть использован для визуализации. Всегда держите открытую кожу уха влажным с помощью буфера Рингера и защищать влажности с помощью покровное. </li><li> В случае, если постоянное кровотечение опухолевые формы сосудов, остановить кровотечение, добавив 100 мклтромбин (5 ед / мл) в буфере Рингера (102 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 28 мМ лактата натрия) в верхней части уха в течение 5 мин. </li><li> Промыть ухо два раза приблизительно 5 мл буфера Рингера и удалить больше жидкости стерильными салфетками. Сразу приступить к следующему шагу (не позволяйте открытым ухо сухой в любой момент!). </li></ol> 3. Иммунофлуоресценции Окрашивание Использовать буфер Рингера с добавлением человеческой сыворотки (1:10), мышь поликлональной вторичным антителом к ​​IgG человека (1:50) и 125 МЕ / мл (2,5 мг / мл апротинина) (блокирующем буфере) в течение всех этапов окрашивания. Апротинин ингибирует плазмин содействие коагуляции ограничить первоначальный кровотечение, которое может произойти после операции. <ol><li> Сложите часть уха с открытыми дермы в eminentia раковин и высушите внешние неоткрытые дермы уха стерильными салфетками. Остановите ухо на стопку стекло, применяя 0,5 мкл хирургического клея к передней и задней тыльных поверхностей стопл края. Затем, аккуратно расправьте уха дермы спинные на стекло. </li><li> Применение первичных антител ориентации внеклеточные матричные молекулы в концентрации 10 мкг / мл в общем объеме 100 мкл блокирующего буфера к открытой уха. Накройте ухо покровным в целях предотвращения красящего раствора для просушки на ухо краев. Инкубировать в течение 15 мин. Вымойте ухо два раза примерно с 5 мл буфера Рингера. </li><li> Применение соответствующих вторичных антител или стрептавидин конъюгатов (флуорофоров с высокой длины волны возбуждения, таких как 594 нм или 647 нм благоприятны для прижизненной визуализации) в концентрации 10 мкг / мл в общем объеме 100 мкл блокирующего буфера к открытой уха. Накройте ухо покровным и инкубировать в течение 15 мин. Вымойте ухо два раза примерно с 5 мл буфера Рингера. </li></ol> 4. Взаимодействие с кровью активированных спленоцитах с опухолевыми клетками в месте <ol><li> 7 дней после inoculatioп-GFP меланомы В16-F10 на заднем кожи конгенных мыши, эвтаназии животных и собирать селезенки. Изолировать спленоцитам с механическим разрушением селезенки через ситечко 70 мкм клетки. </li><li> Этикетка спленоциты в течение 8 мин при 37 ° С с Red CMTPX цитоплазме клеток красителем (1 мкМ в PBS), мыть 4 раза в 15 мл при 4 ° С и сразу же вводить с свободной среде 200 мкл сыворотки в хвостовую вену мыши, чьи уши были засевают B16-F10-GFP 7 дней ранее. </li></ol> 5. Прижизненной визуализации с помощью стереомикроскопа <ol><li> Для кратковременного томографии (до 2 ч), добавьте свежеприготовленный стерильный буфер аскорбат-Рингера, содержащий 140 мМ аскорбата натрия, 10 мМ HEPES, 4 мМ KCl и 5 мМ CaCl 2, при рН 7,5 (буфер финале аскорбат-Рингера осмолярность 320 мОсм) в верхней части с иммобилизованным уха. Накройте ухо покровным и начать визуализацию с помощью флуоресцентного стереомикроскопа с 2X объективом. </li><li> Для долгосрочного изображений(Более 2 ч), поместите выход иглы (подключенного с резервуаром, содержащим буфер аскорбат-Рингера) под покровное, около 0,5 см от уха. С помощью перистальтического насоса со скоростью 1 мкл / мин постоянно доставлять буфер аскорбат-Рингера в камеру под покровное. </li><li> Измените 1X объектив (рабочее расстояние 6 см) до 2X объективом (рабочее расстояние 2 см). Откройте программу приобретения и настройки параметров флуоресцентного стереомикроскопа. В камере, выберите 12 бит, как глубина цвета изображения и отрегулировать камеры спектр серого значений от 0% (минимум) до 5,1% (максимум) и установить гамма-коррекции до 2. <ol><li> Установите усиление приобретение до 1 (минимум), интенсивности флуоресценции до 1000 (максимум), увеличением, установленным в 280x-320X и регулировать время экспозиции предотвращения чрезмерного или недостаточного воздействия (время экспозиции должно быть не менее 1 сек). В зависимости от количества полей изображений (обычно от 10 до 20), интервал времени для цикла сбора должен быть установлен бытьТвин с 1 по 2 мин. Сократить время может привести к отбеливанию и фототоксичность. </li></ol></li><li> Выберите несколько полей, которые содержат опухолевые клетки, а также окрашенные ECM белков (например, на рисунке 3). Использование моторизованный этап, получить изображения соответствующих флуоресцентных каналов (например, GFP и флуорофором 647 на рисунке 3) в течение долгого времени (например, раз в 2 мин). </li><li> После эксперимента, усыпить мышь в соответствии с ведомственным руководящим принципам животных. В этом случае в конце эксперимента, эвтаназии анестезированных мышь цервикальным сдвигом с последующей путем обескровливания (внутрисердечного перфузии). </li></ol> 6. Прижизненной визуализации с помощью многофотонном микроскоп <ol><li> Использование силиконовую смазку, строить круговую стенку около 2 см в диаметре и высотой 2-3 мм вокруг уха, начиная с основания уха. Убедитесь в том, нет утечкой точки. Заполните круг с буфером аскорбат-Рингера. </li><li> Место мышина сцене и подключить грелку (37 ° С). </li><li> Открытое программное обеспечение приобретения и настройки параметров многофотонном микроскопом. </li><li> Выберите до четырех различных полей, содержащих опухолевые клетки и окрашенные белки ECM (например, на рисунке 3). В этом примере настройки лазера Ti-сапфир до 850 нм для GFP сигнал последующего один фотон 647 для флуорофором 647 окрашивания и визуализации фибриллярные коллагены с ГВГ. Получение изображений из соответствующих флуоресцентных каналов (например, GFP и флуорофором 647 на рисунке 3) и генерации второй гармоники с течением времени, например, каждые 2 мин, с погружением в воду HCX APO 20X с 1,00 NA объектива и 2 мм рабочее расстояние. </li><li> После эксперимента, усыпить наркозом мышь с цервикальным сдвигом с последующей обескровливания (внутрисердечное перфузии). </li></ol>

<ol>
	<li>Martinez-Corral, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphatic+vessels+in+development,+wound+healing,+inflammation,+and+tumor+metastasis.">In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci. , (2012).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li><li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+neovascularization+assay+for+screening+regulators+of+angiogenesis+and+assessing+their+effects+on+pre-existing+vessels.">An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels.</a> Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Immunofluorescence+for+Visualizing+the+Microcirculatory+and+Immune+Microenvironments+in+the+Mouse+Ear+Dermis.">Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Steinbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo,+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice.">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+elasticity+of+the+fibronectin+matrix+in+living+cell+culture+visualized+by+fibronectin-green+fluorescent+protein.">Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).</li><li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Tal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+mobilization+from+the+skin+requires+docking+to+immobilized+CCL21+on+lymphatic+endothelium+and+intralymphatic+crawling.">DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling.</a> J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).</li><li>Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , 1-14 (2005).</li><li>Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulation+of+blood+vessel+growth+during+tissue+vascularization.">Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization.</a> Nat Med. 15, 657-664 (2009).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+GFP,+CFP+and+collagen+in+tumors+in+vivo+using+multiphoton+microscopy.">Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy.</a> BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).</li><li>Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+step+in+metastasis:+In+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor.">A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).</li><li>Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+amoeboid+cancer+cell+motility+in+vivo.">Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo.</a> J. Microsc. 231, 441-445 (2008).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453, 51-55 (2008).</li><li>Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+high-speed+intravital+multiphoton+laser+scanning+microscopy+of+microvasculature,+lymphatics,+and+leukocyte-endothelial+interactions.">Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions.</a> Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).</li><li>Giampieri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+dendritic+cell+guidance+by+haptotactic+chemokine+gradients.">Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients.</a> Science. 339, 328-332 (2013).</li><li>Midwood, K. S., Orend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tenascin-C+in+tissue+injury+and+tumorigenesis.">The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis.</a> Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 340-341 (2006).</li><li>Sund, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+derived+biomarkers+in+cancer.">Tumor stroma derived biomarkers in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Brown, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Angiogenesis:+Perspectives+from+Antiangiogenic+Tumor+Therapies.">Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies.</a> Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+in+two-photon+excitation+microscopy.">Photobleaching in two-photon excitation microscopy.</a> Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).</li><li>Jakobsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+trans+potentiates+VEGFR-mediated+angiogenesis.">Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis.</a> Dev Cell. 10, 625-634 (2006).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+regeneration+kinetics+of+lymphatic-specific+photodynamic+therapy+in+the+mouse+dermis.">Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis.</a> Angiogenesis. , (2013).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Значение Здесь мы представляем новый прижизненный микроскопии подход, позволяющий с высоким разрешением и динамической визуализации различных компонентов тканей микроокружения, в том числе фибриллярных а также сетки, как матричных протеинов. Этот метод имеет несколько преимуществ по сравнению с текущими прижизненных методов визуализации: (я) Прижизненные изображения флуоресценции был использован в микроциркуляции исследований, например, для отслеживания утечки растворенного вещества из крови или в лимфатические сосуды, но не было в сочетании с иммунной окраски. (II) Использование генетически модифицированных репортер мышей позволяет для конкретных типов клеток для включения в образ, но требуется их наличие (или значительные усилия для создания новых) и ограничивает количество взаимодействующих типы клеток, которые могут быть изучены. (III) Внеклеточный матрикс могут быть отображены в естественных условиях с использованием генерации второй гармоники, но эта методика может только обнаружить волокнистых коллагены, в результате чего большое количество важных компонентов внеклеточноготаких как базальных мембран, фибронектины, tenascins, факторы роста, хемокинов и ткани гликозаминогликанов вне досягаемости для современных исследований. Наш метод позволяет преодолеть эти ограничения, и позволяет стандартные методы визуализации, которые будут включены и далее в сочетании с immunostainings для других типов клеток, тканевых структур, месторождений гепаринсульфат связывания факторов роста (например, VEGF 26) и хемокинов (CCL-21 5,18 и рис. 2D ), или белки внеклеточного матрикса и одновременно отслеживания крови и / или лимфатические потоков. Недостатки Эпифлуоресцентная визуализации прижизненной IF ограничивается тонких кожных лоскутов, лишенных толщиной подкожного слоя (жировой ткани). В то время как мы обнаружили, что спинной уха дермы является оптимальным для относительно безвредны хирургического экспозиции кожи уха, эпифлуоресцентной с прижизненный IF методика не ограничивается уха дермы и потенциально могут быть применены к напроткрытые участки кожи из ног или задней коже новорожденного мыши. Быстрое окрашивание антителом (15 минут) в иммунофлюоресценции ЕСЛИ не зависит от пассивной диффузии, но требует функциональной лимфодренаж и интерстициальный поток жидкости, следовательно, нет окрашивание не может наблюдаться, если лимфатические сосуды поглощаются 27. В соответствии с этим, лимфатические сосуды пятно сильнее вытекающей сосудистую крови (поврежденные сосуды, артериол) 5. Разделение спинной и брюшной ушанке кожи является мягким хирургическая процедура, но это вызывает повреждение некоторых капилляров и гибели клеток в различные клетки тканей. Это может быть проблемой, когда нужно исследовать полностью неповрежденной ткани, например, глядя на мягкое воздействие наркотиков на выживание клеток. Также применение антиоксидант, который служит для защиты кожи от фототоксичности и фотообесцвечивания исключает использование прижизненной техники иммунофлюоресценции для изучения например, ткани окислительного стресса или азотной Biolog оксидау. Наконец, ослепляя макрофагов ткани резидентов с иммунных комплексов может активировать эти клетки и влияние, например, при изучении тканей иммунной реакции и активации дендритных клеток. Изменения и устранение неисправностей Для изучения тканей окислительный стресс или азотной биологию оксида, аскорбиновая кислота должна быть заменены другими тканей совместимых носителей, не мешает экспериментальной продукции. Точно так же, блокирующие Fc рецепторы на кожных иммунных клеток следует избегать, если цель исследования заключается функция и активация тканевого иммунного ответа и активации дендритных клеток и миграции. Это может быть сделано с использованием вторичного антитела с Fc-фрагментом расщепленного (F (аb) 2-фрагменты антител) или использование биотинилированного антитела и флуоресцентного стрептавидина в качестве реагентов обнаружения. Будущие приложения Мы представляем новый и уникальный интражизненно важным, если метод для изображения компонентов не-фибриллярных внеклеточного матрикса в трансплантации опухолей кожи в сочетании с SHG-обнаруженного фибриллярных и созрели коллагенов, используя двухфотонного микроскопа. Одним из преимуществ использования нескольких фотонов (или конфокальной) микроскопии над изображениями эпифлуоресцентной является г-укладки возможность и в следствие пространственной совместная локализация событий, возникающих на внеклеточного матрикса, например опухоли intravasation в лимфатической или кровеносного сосуда, который в случае Стандарт эпифлуоресцентная микроскопии можно только вывести из морфологических изменений вторжения клетки. Этот метод имеет гораздо более широкий потенциал. Например, мы использовали прижизненной ЕСЛИ чтобы исследовать механизм лимфатической окклюзии по лимфатической конкретных фотодинамической терапии 27. Дополнительные возможности применения данного способа включают, но не ограничиваются ими исследовании иммунитета кожи во время воспаления, механизма отказа или методов крови и лимфы трансплантата<html> рост судно ATIC во опухолей. Критические шаги в процедуре Самый важный шаг, который имеет важные последствия для поддержания физиологического среду ткани является хирургическая разделение брюшной кожи и хряща от спинных дермы. Разрезать или окклюзии основной артерии или вены приведет к чрезмерному кровотечению и местного гипоксии тканей, которые будут влиять на клеточный ответ на лечение и клеточного движения 8. Иммобилизации ухо хирургического клея должно быть сделано с осторожностью, так как разлив клей на подвергайте ткани вызовет постоянные травмы в ткани окклюзии кровеносных сосудов. Температура мыши необходимо контролировать и выдерживают при 37 ° С Кроме того, увлажненный кислород должен быть использован для изофлуран анестезии, так что глаза и легкие остаться должным образом увлажненный в ходе эксперимента. Кроме того, аскорбат натрия должны быть готовы недавно и его рН проверяется перед использованием. ntent &quot;&gt; Таким образом, этот прижизненной иммунофлюоресценции мостов в реальном времени, локальные измерения физиологических функций с молекулярной визуализации сложных клеточных событий в коже мыши. Кроме того, этот метод имеет большой потенциал как она может быть легко применен к исследованию, например, после развития механизмы крови и лимфы-ангиогенеза или визуализировать ранние фазы инфекции кожи различными патогенными агентами. Благодаря гибкости и высокой пропускной потенциал, это прижизненный метод может внести существенный вклад в нескольких областях биологии.

Прижизненной визуализации воспалительных, метастатических и матричных процессах ремоделирования была важной областью исследований и побудило создание многочисленных трансгенных мышиных моделях репортеров, которые выражают флуоресцентные белки 1,2. Из-за из фокуса флуоресцентных сигналов, которые снижают качество изображения и пределы проникновения света через ткань, изображения толщиной ткани возможно только с конфокальной или сканирования многофотонное микроскопии 3. Использование быстрее, менее дорогим и сложным эпифлуоресцентная микроскопии возможно только с почти двумерных тканей, таких как курица CHORIO-аллантоисной мембраны 4 или мыши уха дермы 5. Большинство систем визуализации воспользоваться трансгенных мышей, экспрессирующих различные флуоресцентные белки в зависимости от конкретного типа моды клеток. Даже если эти белки предложить слабый фототоксичность, они индуцируют иммунный ответ 6. Кроме того, трудно для переключения между специфических клеток подтипов или пометитьИК базальная или активированные государства как такого изменения требует подготовки нового генетической модели. Кроме того, как выражение флуоресцентный белок обычно ограничивается внутриклеточное пространство, обычно не представляется возможным изображения внеклеточных структур, таких как подвал мембранных белков или тканей хемокинов отложений 7. Вместо этого, косвенное маркировка с антителами против внеклеточных антигенов обеспечивает гибкость для практически любого камерного типа или матрицы конкретного компонента 8,9. Однако главным недостатком этого подхода маркировки связано с иммунотоксичности опосредованного антиген-антитело иммунных комплексов, которые могут вызвать Система комплемента в зависимости от токсичности клеток и фагоцитоз клеток и внеклеточных структур 10. Внеклеточный матрикс из микросреды опухоли, но и нормальной ткани при воспалении или заживления ран, претерпевает существенную модернизацию. Стромальный ужесточение микросреды опухоли может промоТе рост и инвазия опухоли из-за стресс-индуцированных сигнальных механизмов и причин ремоделирования кровеносных и лимфатических сосудов 11. Тем не менее, жить изображений матричных белков ограничивается фибриллярных коллагенов, которые могут быть обнаружены с помощью генерации второй гармоники с помощью нескольких фотонов микроскопии. Недавно мы опубликовали новый прижизненный метод визуализации, которая сводит к минимуму риск фото-и иммуно-токсического повреждения отображаемого клеток и тканевых структур 5. По сравнению с установленными методов визуализации, где один раунд непрерывной прижизненной визуализации находится в диапазоне от 30 минут до 2 часов 12-17, наша прижизненный иммунофлюоресценции (ИФ) методика позволила 12 часов (долгосрочные 8) изображений. Важно отметить, что время визуализации ограничена до 12 часов из-за пределов, определенных в нашем протоколе животных, но нет никаких технических противопоказания, что он не может быть продлен, если критические параметры для здоровья животного, как кровяное давление и сердцеСкорость контролируется 8. Кроме того, с помощью автоматизированной флуоресценции стереомикроскоп мы смогли собрать изображения с нескольких полей во время одного эксперимента и наблюдали редкие иммунологические и реконструкции процессов, происходивших в физиологическом контексте кожи, поддерживаемой функциональной кровеносных и лимфатических сосудов. Поскольку stereomicroscopic линза имеет относительно большой, 2 см, рабочее расстояние и в отличие от двухфотонных микроскопических оптики не требует испарения воды погружение, долговременные изображений была выполнена только под флуоресцентным стереомикроскопа. Прижизненные если это разрешено иммунную маркировки и обнаружения любого внеклеточного матрикса составляющей нормальной кожи. Конструкция этой техники основано на инновационной концепции использования иммуноокрашивания для живых клеток и матричных ткани элементов на хирургическим подверженных дермы мыши, не вызывая вредные иммунотоксичном воздействии 5. Сама хирургическая процедура является безопасной в дермусосудистую, поскольку основывается только на принципе разделения двух слоев кожи в ухе, которые независимо иннервируются, автономно питается кровью и осушенных отдельными лимфатических тиражами. Наша экспериментальная установка позволяет изображений из ряда важных патофизиологических событий более не менее 12 часов, включая торговлю лейкоцитов между кровеносных и лимфатических сосудов и заживление ран процессов. В оригинальной публикации, мы сравнили нашу технику, чтобы государством в самых современных стандартов в различных областях прижизненной визуализации. Следовательно, мы наблюдали крови экстравазации сосудов и лимфатические события intravasation различными типами лейкоцитов, в том числе уникальной визуализации иммунных клеток, поступающих сбора вместо ожидаемого начальные лимфатические сосуды 15. Кроме того, дополняя наблюдения, выполненные другими группами 9,18, мы обнаружили, что в естественных условиях CCL21 способен образовывать сильные, разрывные отложений на сбор, но лишь изредка на начальных лимфатические сосуды. <p cдевушка = &quot;jove_content&quot;&gt; Здесь мы опишем модифицированную прижизненной ЕСЛИ техника, которая может сочетаться с двухфотонного микроскопии для обнаружения сеть фибриллярных коллагенов использованием генерации второй гармоники (ГВГ). Показано, что этот метод также может быть использован для инвазии раковых клеток изображения в контексте динамического микроокружения опухоли, который включает молекулы матрикса, такие как тенасцину C, которые в значительной степени неисследованным текущими методов визуализации 19. Мы обнаружили, что фибриллярная матрица опухоли, обнаружены с генерации второй гармоники, занимает различные местоположения опухоли микроокружения, чем недавно нанесенной матрицы, составленной из тенасцина С. Кроме того, мы опишем примеры реконструкции сосудов, вызванные местной сокращения матрицы, долго- Термин (12 часов) визуализации Т-клеточных взаимодействий с опухолевых клеток и опухолевых клеток миграции вдоль коллагена IV базальной мембраны. Такие события могут быть отображены одновременно записывая местные физиологических параметров, таких как ре кровеносных сосудовrmeability и лимфодренаж.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="966">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mice Strain</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BALB/C mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Charles River&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orleans,France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">C57/Bl6 Mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Harlan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Carshalton UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Line&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Anesthesia Maintenance&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Minrad Inc.&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2222</td>
			<td>Minrad Inc., Buffalo, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified delivery system&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Rothhacher GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Berne, Switzerland&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DC Temperature Control System&#160;</td>
			<td style="width:159px;">FHC Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bowdoin, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage .</td>
			<td style="width:159px;">M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">&#160;1&#215; lens (linear system magnification from 7.5&#215; to 160&#215;)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">2&#215; lens (linear system magnification from 15.6&#215; to 320&#215;)</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Multiphoton Microscopy&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX APO 20x/1.2 oil immersion&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chameleon Ultra Laser&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">Ringer&#39;s buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate)</td>
			<td>B. Braun Medical AG</td>
			<td align="right">445968</td>
			<td>Sempach, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Aprotinin&#160;</td>
			<td>Elastin</td>
			<td>AP92</td>
			<td>Owensville, MO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Thrombin&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7326-1KU&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11140-50G&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mouse Serum raised against human IgG&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Abcam&#160;</td>
			<td>ab34834&#160;</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Collagen IV&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6581</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Perlacan&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>ab79465&#160;</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Tenascin C&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>AF3358</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Podoplanin</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AF3244</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">LYVE-1&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Reliatech&#160;</td>
			<td>103-PA50&#160;</td>
			<td>Wolfenb&#252;ttel, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CCL21</td>
			<td style="width:159px;">RnD</td>
			<td style="width:119px;">AF457</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Pacific Blue&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S11222</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 647&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S21374</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 488&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S11223</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Goat 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21113</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Rabbit 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CMTPX CellTracker</td>
			<td style="width:159px;">Lifetechnologies</td>
			<td style="width:119px;">C34552</td>
			<td>Carlsbad, California</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Histocryl (surgical glue)</td>
			<td style="width:159px;">Braun Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">1050060</td>
			<td>Tuttlingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Culture Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>E15-843&#160;</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term intravital immunofluorescence imaging of tissue matrix components with epifluorescence and two-photon microscopy

Помимо того, что физическая леса для поддержания тканей морфологию, внеклеточный матрикс (ECM) активно участвует в регуляции функции клеток и тканей в процессе разработки и органов гомеостаза. Он делает это, выступая в через биохимических, биомеханических, и биофизических сигнальных путей, например, через освобождение биологически активных фрагментов ECM белка, регулирующего ткани напряженности и обеспечение пути для миграции клеток. Внеклеточный матрикс из микросреды опухоли подвергается существенной ремоделирования, характеризующийся деградации, осаждения и организации фибриллярных и не фибриллярных белков матрикса. Стромальный ужесточение микросреды опухоли может способствовать росту опухоли и инвазии, и вызвать ремоделирования кровеносных и лимфатических сосудов. Живая съемка матричных протеинов, однако, на данный момент ограничивается фибриллярных коллагенов, которые могут быть обнаружены с помощью генерации второй гармоники с помощью нескольких фотонов микроскопии, оставляя большую часть компонентов матрицы лargely невидимым. Здесь мы описываем процедуры инокуляции опухоли в тонкой спинного уха кожи, иммунного белков внеклеточного матрикса и прижизненной визуализации открытой ткани в живых мышей с использованием эпифлуоресцентной и двухфотонного микроскопии. Наша прижизненный метод визуализации позволяет для прямого обнаружения как фибриллярных и матричных протеинов без фибриллярных в контексте растущей опухоли кожной. Мы показываем примеры реконструкции сосудов, вызванные местной сокращения матрицы. Мы также обнаружили, что фибриллярная матрица опухоли обнаружены с генерации второй гармоники пространственно отличие от недавно депонированных матричных компонентов, таких как тенасцина С. Мы также показали долгосрочные (12 часов) визуализации взаимодействия Т-клеток с опухолевыми клетками и опухолевых клеток миграция вдоль коллагена IV базальной мембраны. Взятые вместе, этот метод позволяет однозначно для одновременного обнаружения опухолевых клеток, их физического микросреды и эндогенного иммунного ответа ткани с течением времени, что может провязь важную информацию о механизмах, лежащих в основе прогрессии опухоли и конечный успех или устойчивость к терапии.

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy at JoVE.com

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Внеклеточный матрикс подвергается существенной ремоделирования во время заживления ран, воспаления и опухолей. Мы представляем новый прижизненный подход иммунофлюоресценции микроскопии для визуализации динамику фибриллярных а также сетки, как компоненты матрицы с высоким пространственным и временным разрешением, используя эпифлуоресцентной или двухфотонного микроскопа.

Долгосрочный Прижизненные Иммунофлуоресценции Визуализация тканей компонентов матрицы с эпифлуоресцентной и двухфотонного микроскопии

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Бесконтактная, этикетки без мониторинга клеток и внеклеточного матрикса использованием спектроскопии комбинационного

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-орган Chip - Микрожидкостных Платформа для долгосрочных Multi-ткани сокультивирования

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Долгосрочный живых изображений устройства для улучшения экспериментальных манипуляций личинок данио рерио

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Новый метод наложения швов теноррафи с тканевым коллагеновым трансплантатом для восстановления больших дефектов сухожилий

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Поджелудочная ткань-производные внеклеточной матрицы Bioink для печати 3D-клетки-Ладена поджелудочной железы Конструкции Конструкции

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Targeting the Rat's Small Bowel: Long-Term Infusion into the Superior Mesenteric Artery

Нацеливание на тонкую кишку крысы: долгосрочная инфузия в верхнюю брыжеечную артерию

The superior mesenteric artery can be cannulated in humans through minimally invasive radiological catheterization of the femoral or axillary artery. SMA ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Простой микрофлюидный чип для долгосрочного роста и визуализации Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Доступная кислородная микроскопия с помощью биофабрикации многоклеточных сфероидов

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...