Name: super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles
Uploaded: 2014-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья предоставляет 2 R15 GM061539-02 (для BAS), 2 R15 NS40425-03 (в JEL), MH 66179 (доктора Гэри банкир Oregon Health &amp; Science University / OHSU) и P30 NS061800 (доктора Сью Aicher из OHSU). Мы благодарим Барбара Smoody за всестороннюю поддержку с культурой нейронов гиппокампа, и доктора. Брайан Лонг и Джеймс Abney для критического прочтения этой рукописи.

1. Подготовка образца <ol><li> Подготовка ДНК, кодирующей photoconvertible или Фотоактивируемые химеру, ориентированные на DCVS, с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Примечание: Одна из возможностей состоит ДНК, кодирующей тканевой активатор плазминогена-Dendra2 химера (ТА...

<ol>
	<li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components.">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li><li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+a+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li><li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging.">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation.">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite.">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li><li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate.">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li><li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+the+presynaptic+active+zone:+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle.">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li><li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets.">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li><li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li><li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons.">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking.">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li><li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney:+A+kinetic+study+of+fixation.">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems.">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+presence+of+noise.">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li><li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li><li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis.">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+localization+microscopy+(PALM):+an+optical+technique+for+achieving+~10-nm+resolution.">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity.">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li><li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes.">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li></ol>

PALM и связанные флуоресценции методы микроскопии сверхвысокого разрешения в последнее время появились в качестве ценного дополнения к лучше-установленным формам оптической микроскопии и электронной микроскопии (ЭМ) 22-24. Положительные атрибуты PALM включают относительно простой ?...

Ряд клеточных процессов зависит от точного и эффективного везикул-опосредованной торговли биомолекул на конкретные субклеточных направлений. Один из ярких примеров является синаптической собрание, которое предшествует долго колебался, везикул-опосредованной доставки синаптических компонентов из сайтов биогенеза в нейронной сомы к потенциально дистальных пред-и постсинаптических участках 1. Флуоресцентная микроскопия является мощным и популярным методом изучения торговлей пузырьков. Сильные стороны метода относятся его чувствительность, специфичность и совместимость с живого изображения 2. К сожалению, до сравнительно недавнего времени, техника не пострадал от одного из основных недостатков, дифракционной разрешением 2, что затрудняет исследования структур с размерами, меньшими, чем ~ 250 нм. Недавно, боковая разрешение в флуоресцентной микроскопии превзошел дифракции барьер с введением флуоресценции ми супер-разрешениямикроскопия методы, такие как PALM 3. Боковое разрешение PALM, десятки нанометров, идеально подходит для изучения пузырьков, которые имеют размеры, которые, как правило, варьируются от ~ 50-250 нм 4. Таким образом, теперь можно использовать флуоресценцию, с его бесчисленными сильные стороны, чтобы пролить свет на спектр ранее недоступных атрибутов пузырьков, в том числе некоторые аспекты их торговли на конкретные субклеточных сайтов. PALM не является тривиальной в реализации, и успешные стратегии часто должны быть адаптированы к типу исследуемой системы. Здесь мы опишем, как реализовать исследований ладони везикулярного структур, и мы продемонстрировать эффективность нашего подхода для случая DCVS в нейронах гиппокампа. В частности, мы используем PALM обратиться гипотезу, что торговля DCVS чтобы синапсов в нейронах гиппокампа опосредуется DCV кластеров 5-8. Кластер-опосредованной торговля пузырьков в синапсах в развивающихся пeurons является интригующая возможность, потому что это может способствовать скорейшей стабилизации синапсов и сборку 9,10. Сторонники кластерного торговли DCVS привести большой видимый размер extrasynaptic флуоресцентного Puncta укрывательство экзогенный DCV груз как доказательств, подтверждающих кластеризации 6. Однако эти Puncta На изображениях появляются генерируемых с помощью дифракционной флуоресценции методы микроскопии, которые не подходят для отличительных размерных эффектов, возникающих от дифракции от тех, которые вызваны кластеризации. Чтобы решить эту проблему, мы собрали обычную флуоресценции широким полем зрения и пальмовое образы нейронов гиппокампа, выражающих химеры, ориентированные на DCVS. Анализ этих изображений показал, что&gt; 92% предполагаемых extrasynaptic кластеров DCV в обычных изображений решаются как 80 нм (индивидуальное DCV размера) 11 Puncta в Палм-изображений. Таким образом, эти данные в значительной степени недействительным кластеризации гипотезу применительно к DCVS в разработке hippocampal нейроны.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> Обнаружение флуоресценции обеспечивает основу для многих широко используемых и быстро развивающихся методов микроскопии, занятых в современных биологических и медицинских приложений. Сильные флуоресценции включают его чувствительности, специфичности и совместимость с живого изображения. К сожалению, обычные формы флуоресцентной микроскопии страдают от одного крупного слабость, разрешение дифракционной в плоскости изображения, что затрудняет исследования структур с размерами, меньшими, чем ~ 250 нм. В последнее время это ограничение было преодолеть с введением методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, таких как фотоактивируемой локализации микроскопии (PALM). В отличие от своих обычных аналогов, PALM может создавать изображения с пространственным разрешением в десятки нанометров. Таким образом, теперь можно использовать флуоресценцию, с его бесчисленными сильные стороны, чтобы пролить свет на спектр ранее недоступных атрибутов клеточной структуры и организации. _content &quot;&gt; К сожалению, PALM не является тривиальной в реализации, и успешные стратегии часто должны быть адаптированы к типу изучаемой системы. В этой статье мы покажем, как реализовать одноцветных PALM исследования везикулярного структур на рынке фиксированных, культивируемых нейронов. PALM идеально подходит для изучения пузырьков, которые имеют размеры, которые, как правило, варьируются от ~ 50-250 нм. Ключевые шаги в нашем подходе включают маркировки нейронов с photoconvertible (зеленый на красный) химеры пузырьков груза, собирая редко выборочные необработанных изображений с Система микроскопии супер-разрешения и обработки необработанных изображений с целью выработать PALM изображение высокого разрешения. Мы также продемонстрировать эффективность нашего подхода, представляя исключительно хорошо решены образы плотной основных пузырьков (DCVS) в культивируемых нейронах гиппокампа, которые опровергают гипотеза, что extrasynaptic торговля DCVS опосредуется в основном DCV кластеров.

На рисунке 1 показана одна конечный продукт обработки изображений и обработки. В этом PALM изображения, боковые координаты локализованных флуорофорами показаны в режиме центроидной дисплея, а также супер-разрешение изображения соответствующего DCV показан в режиме Gaussian дисплея...

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles at JoVE.com

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Опишем, как реализовать фотоактивируемые локализации микроскопии (PALM) на основе исследования пузырьков в основной, культивируемых нейронов. Ключевые компоненты нашего протокола включают маркировки пузырьки с photoconvertible химер, собирая редко выборочные необработанных изображений с системой микроскопии сверхвысокого разрешения, и обработка исходных изображения на продукцию супер-разрешение изображения.

Супер-Resolution Imaging нейронных Плотные-ядерные пузырьков

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

В естественных изображений из Dauer конкретным нейронов ремоделирования в C. Элеганс

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Длительная инкубация Острый нейронную ткань для электрофизиологии и кальций-изображений

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Хронический транскраниальной электростимуляции и Intracortical запись в крыс

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Количественные подходы для скоринга in vivo Neuronal Aggregate и Organelle Extrusion в больших экзоферных пузырьках в C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Супер-разрешение изображения для изучения совместной локализации белков и синаптических маркеров в первичных нейронов

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Подготовка взрослых Drosophila меланогастер для всего мозга изображений во время поведения и стимулов ответы

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Визуализация живых клеток ROS во время развития нейронов

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...