Name: immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. S. Stella e Helen Vuong per contributi al protocollo di imaging del calcio. Ringraziamo Fogli Dr. K. per girare le scene di intervista. Ringraziamo il Dr. Arlene Hirano per i suoi commenti sul manoscritto. Questo progetto di ricerca e sviluppo è stata condotta da presso la David Geffen School of Medicine presso la UCLA autori ed è reso possibile da un accordo di contratto che è stato assegnato e gestito dal Medical Research e Materiel Command dell&#39;Esercito degli Stati Uniti (USAMRMC) e la Telemedicina &amp; Advanced Technology Research Center (TATRC), a Fort Detrick, nel Maryland sotto Numero del contratto: W81XWH-10-2-0077. Il supporto per questi studi è arrivato anche dal NIH EY04067 e una recensione Merito VA (NB). BCN è un VA Career Research Scientist.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere degli animali da esperimento emesse dalla politica US Public Health Service on Human Care e uso di animali da laboratorio e la University of California-Los Angeles (UCLA) comitato per la ricerca degli animali. Sono stati utilizzati Maschio e femmina adulto ratti Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) tra l&#39;età di 3-5 settimane. 1. animali e tessuti Preparazione Wholemount Retina e Immu...

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina.">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li><li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons,+but+is+less+specific+for+individual+cell+types.">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li><li>Margolis, D. J., Detwiler, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion.">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li><li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit.">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li></ol>

In questo articolo, abbiamo descritto due diverse tecniche: 1) L&#39;immunoistochimica per mostrare Fluo-4 localizzazione delle cellule gangliari della retina in wholemounts, e 2) Calcio Imaging per analizzare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni. Immunoistochimica utilizzando wholemounts è stato utilizzato per rivelare la localizzazione delle proteine ​​nei roditori retina 20-23. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni. La qualità della c...

Cellule gangliari retiniche (RGC) esprimono L, N-, P / Q e T-tipo VGCC come determinato attraverso il blocco farmacologico di queste componenti della cellula intera Ca canale corrente 1,2. VGCC sono proteine ​​transmembrana multimerici che sono coinvolte nel rilascio del trasmettitore, la trascrizione del gene, regolazione cellulare e sinaptica plasticità 3,4,5. VGCCs funzionali sono costituiti da almeno tre classi distinte di subunità: grandi, transmembrana α 1 formano pori subunità che stabiliscono proprietà biofisiche e farmacologiche del canale, α ausiliario principalmente extracellulare 2 subunità δ e subunità β intracellulari. Gli ultimi due complessi di forma eteromerici con diverse subunità α 1 e alterano la cinetica gating e il traffico dei canali alla membrana plasmatica 6. Negli ultimi decenni, molte tecniche sono state impiegate per lo studio delle proteine ​​espresfissione, come la immunoistochimica, enzyme-linked test immunoenzimatico, analisi occidentale e citometria a flusso. Queste tecniche richiedono l&#39;uso di anticorpi specifici per l&#39;individuazione di una data proteina di interesse e forniscono strumenti potenti per la localizzazione e la distribuzione di proteine ​​specifiche nei diversi tessuti. Le tecniche utilizzate per rilevare e quantificare i livelli di espressione di mRNA di una particolare proteina come l&#39;analisi Northern blot, RT-PCR, real-time RT-PCR, ibridazione in situ, cDNA microarray e analisi di protezione della ribonucleasi forniscono un approccio alternativo quando gli anticorpi non sono facilmente livelli di espressione disponibile o se di una particolare proteina sono bassi 7. Tuttavia, una limitazione all&#39;uso di tali tecniche molecolari è l&#39;identificazione desiderata della sequenza genica. Per localizzare proteine ​​nella retina, immunoistochimica può essere eseguita su retine wholemount. A causa della accessibilità dei RGCs, la wholemountpreparazione fornisce una piattaforma eccellente per studiare la localizzazione di specifiche proteine ​​al somata RGC e dei loro assoni. Oltre alla loro localizzazione, alcune proprietà funzionali dei VGCCs in RGC sono evidenziabili attraverso l&#39;uso di tecniche di imaging calcio. Descriviamo un protocollo di imaging del calcio di etichettare selettivamente RGCs con un indicatore di calcio colorante per misurare la dinamica del calcio intracellulare. Il contributo di diversi VGCCs al segnale calcio in differenti compartimenti cellulari può essere isolata con l&#39;uso di specifici del sottotipo Ca bloccanti dei canali. Forse uno degli aspetti più positivi della tecnica di imaging del calcio qui descritta è la capacità di registrare simultaneamente e indipendentemente da più RGCs e dei loro assoni. Anche se molte tecniche fisiologiche, come ad esempio intera registrazione patch clamp cellulare, forniscono ad alta risoluzione temporale registrazioni delle correnti di membrana, il somatico o fonte assonale di thesE le correnti registrate non possono essere discriminati e registrazioni possono essere effettuate solo da un singolo neurone alla volta. Array multielettrodico (MEA) sono in grado di registrare simultaneamente punte da molte cellule, ma possono né rilevare né discriminare l&#39;attivazione di, ad esempio, diversi sottotipi di canali del calcio. MEAS preferenzialmente registrare da cellule che si trovano in prossimità di un dato elettrodo 8 e registrare da cellule che generano grandi picchi 9. Metodi di imaging ottici forniscono una strategia alternativa per consentire le registrazioni simultanee e indipendenti di intere popolazioni di cellule che possono essere integrate con le informazioni ottenute da microelettrodo singola cellula e la registrazione patch clamp e la registrazione MEA. Sebbene le tecniche di imaging del calcio qui descritti sono stati impiegati per studiare la dinamica del calcio di RGCs, patch clamp e MEA può essere utilizzato anche in parallelo per chiarire ulteriormente le correnti ioniche e spiking proprietà dei RGCs. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Dato che le cellule amacrine sfollati costituiscono circa il 60% della popolazione neuronale nello strato di cellule gangliari della retina di topo 10, il nostro obiettivo era quello di utilizzare una tecnica di carico che etichette selettivamente RGCs con un indicatore di calcio sintetico colorante in un preparazione wholemount. Sebbene coloranti sintetici indicatori di calcio offrono una piattaforma eccellente per lo studio della dinamica del calcio intracellulare, la sua diffusione è stata ostacolata dall&#39;incapacità di caricare efficacemente specifiche popolazioni di neuroni all&#39;interno di una data rete. Molte tecniche come la massa di carico 11 ed elettroporazione 8,12 sono stati eseguiti per caricare intere popolazioni di cellule, tuttavia, tali tecniche non discriminano tra i tipi cellulari specifici. Geneticamente codificati indicatori di calcio offrono la possibilità di etichettare selettivamente specifiche popolazioni di cellule, tuttavia, tali metodi richiedono la generazione di animali transgenici 13. La nostra tecnica descrive un metod di etichettare selettivamente RGCs nella preparazione wholemount tramite ottico iniezione moncone del nervo di un indicatore di calcio colorante. Nel loro insieme, le tecniche strutturali e fisiologiche descritte in questo articolo fornire una piattaforma per studiare la localizzazione e il contributo delle VGCCs al segnale calcio nel RGCs e dei loro assoni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">14124-G</td>
			<td style="width:229px;">dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight Forceps</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">curved iris scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td>504487</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hibernate A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=A1247501">A12475-01</a></td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1000&#160;</td>
			<td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=web&amp;cd=1&amp;cad=rja&amp;sqi=2&amp;ved=0CC0QFjAA&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">Mounting Media for Fluorescence</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 pentapotassium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-178-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:112px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RBPMS</td>
			<td style="width:112px;">ProSci, Poway, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>A rabbit polyclonal antibody&#160;was generated against the N-terminus of the RBPMS&#160;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

In questo documento si descrivono gli strumenti, reagenti, e le misure pratiche che sono necessarie per: 1) preparazione di successo di retine wholemount per immunoistochimica e, 2) Calcio Imaging per lo studio di tensione gated canali del calcio (VGCC) mediata segnalazione di calcio in retina cellule gangliari. Il metodo di imaging del calcio descriviamo questioni aggira in materia di non-specifico carico di cellule amacrine sfollati nello strato di cellule gangliari.

Immunomarcatura con anticorpi specifici fornisce una piattaforma per studiare la localizzazione di particolari proteine ​​di interesse nella retina e la tecnica di imaging calcio permette lo studio del contributo dei VGCCs verso le dinamiche di calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni. Utilizzando un anticorpo contro le RBPMS proteine ​​delle cellule gangliari (RNA binding protein con splicing multipla) che identifica selettivamente RGCs 19, siamo stati i...

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Immunoistochimica protocolli sono utilizzati per studiare la localizzazione di una specifica proteina nella retina. Tecniche di imaging di calcio sono impiegate per studiare le dinamiche del calcio nelle cellule gangliari retiniche e dei loro assoni.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

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Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

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Neuroscienze

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The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

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Calcio dei periciti cerebrali e imaging emodinamico nei topi transgenici in vivo

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