Name: immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina at JoVE.com

Agradecemos al Dr. S. Stella y Helen Vuong de contribuciones para el protocolo de imágenes de calcio. Agradecemos Hojas Dr. K. para el rodaje de las escenas de la entrevista. Agradecemos al Dr. Arlene Hirano por sus comentarios sobre el manuscrito. Este proyecto de investigación y desarrollo se llevó a cabo por los autores en la Escuela David Geffen de Medicina en UCLA y es posible gracias a un acuerdo de contrato que se adjudicó y administrado por el Comando de Investigación y Material Médico del Ejército de EE.UU. (USAMRMC) y la tecnología de la telemedicina y Avanzado Centro de Investigación (TATRC), en Fort Detrick, MD con el Número de Contrato: W81XWH-10-2-0077. El apoyo a estos estudios también provino de NIH EY04067 y opiniones de Mérito VA (NB). BCN es un VA Carrera del Investigador Científico.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices para el bienestar de los animales de laboratorio emitidos por la Política de Servicio de Salud Pública en Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio y la Universidad de California-Los Ángeles (UCLA) Comité de Investigación Animal. Se utilizaron masculino y femenino adulto ratas Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre la edad de 3-5 semanas. 1. Animal y Tejidos Preparación para Wholemount Re...

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	<li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat.">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li><li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4.">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li><li>Caterall, W. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina.">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li><li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons,+but+is+less+specific+for+individual+cell+types.">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li><li>Margolis, D. J., Detwiler, P. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina.">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li><li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging.">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li><li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter.">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li><li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells.">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li><li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion.">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li><li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit.">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li></ol>

En este artículo, hemos descrito dos técnicas diferentes: 1) La inmunohistoquímica para mostrar Fluo-4 a la localización de las células ganglionares de la retina en wholemounts, y 2) El calcio de imágenes para analizar la dinámica de calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones. La inmunohistoquímica utilizando wholemounts se ha usado para revelar la localización de las proteínas en el roedor retina 20-23. Sin embargo, hay algunas limitaciones. La calida...

Las células ganglionares de la retina (CGR) expresan L, N, P / Q y de tipo T VGCC como se determina a través del bloqueo farmacológico de estos componentes de la célula entera Ca canal actual 1,2. VGCC son proteínas multiméricas transmembrana que están implicados en la liberación del transmisor, la transcripción de genes, la regulación celular y 3,4,5 plasticidad sináptica. VGCCs funcionales se componen de al menos tres clases distintas de subunidades: grandes, transmembrana α 1 formador de poros subunidades que establecen propiedades biofísicas y farmacológicas del canal, principalmente extracelular auxiliar α 2 δ subunidades y las subunidades β intracelulares. Los dos últimos complejos heteroméricos forma con diferentes subunidades α 1 y alterar la cinética de activación periódica y el tráfico de los canales a la membrana plasmática 6. En las últimas décadas, muchas técnicas se han empleado para estudiar la proteína expresión, como la inmunohistoquímica, ensayo inmunoenzimático, el análisis occidental y citometría de flujo. Estas técnicas requieren el uso de anticuerpos específicos para la detección de una proteína dada de interés y proporcionan potentes herramientas para la localización y distribución de proteínas específicas en diferentes tejidos. Las técnicas utilizadas para detectar y cuantificar los niveles de expresión de ARNm de una proteína en particular, como el norte de blot, RT-PCR en tiempo real cuantitativa RT-PCR, hibridación in situ, microarrays de ADNc y ensayo de protección de ribonucleasa proporcionan un enfoque alternativo cuando los anticuerpos no son fácilmente los niveles de expresión disponible o si de una proteína particular son bajos 7. Sin embargo, una limitación al uso de tales técnicas moleculares es la identificación requerido de la secuencia del gen. Para localizar proteínas en la retina, inmunohistoquímica se puede realizar en retinas wholemount. Debido a la accesibilidad de la CGR, la wholemountpreparación proporciona una excelente plataforma para el estudio de la localización de las proteínas específicas del somata RGC y sus axones. Además de su localización, algunas propiedades funcionales de los VGCCs en CGR se pueden demostrar mediante el uso de técnicas de imagen de calcio. Se describe un protocolo de imágenes de calcio para etiquetar selectivamente CGR con un colorante indicador de calcio para medir la dinámica del calcio intracelular. La contribución de las diferentes VGCCs a la señal de calcio en diferentes compartimentos celulares se puede aislar con el uso de bloqueadores de los canales de Ca subtipo específico. Quizás uno de los aspectos más beneficiosos de la técnica de imagen de calcio descrito aquí es la capacidad de grabar simultáneamente y de forma independiente a partir de múltiples CGR y sus axones. Aunque muchas técnicas fisiológicas, como la grabación de patch clamp de célula entera, proporcionan altos grabaciones resolución temporal de las corrientes de membrana, la somática o fuente axonal de thescorrientes e grabados no pueden ser discriminados y grabaciones sólo se pueden hacer de una sola neurona a la vez. Arrays multielectrodo (AAM) son capaces de registrar simultáneamente picos de muchas células, pero tampoco pueden detectar ni discriminar la activación de, por ejemplo, los diferentes subtipos de canales de calcio. Meas preferentemente grabar a partir de células que se encuentran en las proximidades de un electrodo 8 y registro de las células que generan grandes picos 9. Métodos de imagen ópticos proporcionan una estrategia alternativa para que las grabaciones simultáneas e independientes de toda la población de células que se pueden integrar con la información obtenida a partir de una sola célula de microelectrodos y grabación de patch clamp y grabación MEA. Aunque se emplearon las técnicas de imagen de calcio descritos aquí para estudiar la dinámica de calcio de CGR, patch clamp y AAM también se pueden utilizar en paralelo a aclarar aún más las corrientes iónicas y propiedades enriquecidas de CGR. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Dado que las células amacrinas desplazadas constituyen aproximadamente el 60% de la población neuronal en la capa de células ganglionares de la retina en el ratón 10, nuestro objetivo era utilizar una técnica de carga que etiqueta selectivamente CGR con un colorante indicador de calcio sintético en una preparación wholemount. Aunque colorantes indicadores de calcio sintéticos proporcionan una excelente plataforma para el estudio de la dinámica de calcio intracelular, su uso generalizado se ha visto obstaculizado por la incapacidad para cargar eficazmente poblaciones específicas de neuronas dentro de una red dada. Se han realizado muchas técnicas, tales como carga a granel 11 y 8,12 electroporación para cargar poblaciones enteras de células, sin embargo, estas técnicas no discriminan entre tipos de células específicos. Genéticamente codificados indicadores de calcio proporcionan la capacidad de etiquetar selectivamente poblaciones específicas de células, sin embargo, tales métodos requieren la generación de animales transgénicos 13. Nuestra técnica describe un method etiquetar selectivamente CGR en la preparación wholemount vía óptica inyección muñón del nervio de un colorante indicador de calcio. En conjunto, las técnicas estructurales y fisiológicos descritos en este artículo proporcionan una plataforma para estudiar la localización y la contribución de los VGCCs a la señal de calcio en la CGR y sus axones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">14124-G</td>
			<td style="width:229px;">dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight Forceps</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">curved iris scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td>504487</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hibernate A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=A1247501">A12475-01</a></td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1000&#160;</td>
			<td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=web&amp;cd=1&amp;cad=rja&amp;sqi=2&amp;ved=0CC0QFjAA&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">Mounting Media for Fluorescence</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 pentapotassium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-178-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:112px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RBPMS</td>
			<td style="width:112px;">ProSci, Poway, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>A rabbit polyclonal antibody&#160;was generated against the N-terminus of the RBPMS&#160;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

En este trabajo se describen las herramientas, los reactivos y las medidas prácticas que se necesitan para: 1) preparación exitosa de retinas wholemount para inmunohistoquímica y, 2) imágenes de calcio para el estudio de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCC) mediada por la señalización de calcio en la retina células ganglionares. El método de imagen de calcio describimos elude cuestiones relativas a la carga no específico de células amacrinas desplazadas en la capa de células ganglionares.

Inmunomarcaje con anticuerpos específicos proporciona una plataforma para estudiar la localización de proteínas particulares de interés en la retina y la técnica de imagen de calcio permite el estudio de la contribución de los VGCCs a la dinámica de calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones. Mediante el uso de un anticuerpo contra las células ganglionares RBPMS proteína (proteína de unión de ARN con múltiples empalme) que etiqueta selectivamente CGR 19,</...

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Protocolos de inmunohistoquímica se utilizan para estudiar la localización de una proteína específica en la retina. Se emplean técnicas de imagen de calcio para estudiar la dinámica del calcio en las células ganglionares de la retina y sus axones.

Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Parénquima no invasiva, vascular y metabólico de alta frecuencia de ultrasonido y fotoacústica Rata cerebral profunda Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

Imágenes de calcio en retinas planas estimuladas eléctricamente

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...