Name: rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NCI.

1.. Udarbejdelse af Master Stocks <ol><li> Lav mester lagre af forbindelserne, der skal testes i DMSO. Forbered lagrene på et standard koncentration på 20 mM. Bemærk: enhver koncentration over 10 mm kan anvendes. Forbindelser, der kan anvendes som positive kontroller til at validere denne analyse omfatter RAL, EVG, og DTG. </li><li> Sikre forbindelserne opløses i DMSO ved hvirvelbehandling opløsningerne flere gange i 15 sekunder og inkubering ved stuetemperatur i 1 time. Opbevar 20 mM stamopløsninger i mørke ved -20 ° C indtil brug. </li></ol> 2. Fremstilling af 96-brønds plader for Forbindelse Screening <ol><li> Vælg den cellelinie, der skal testes (fx HOS ​​eller TZM-bl) og frø 100 pi af disse celler ved en densitet på 4 x 10 4 celler / ml (4000 celler / brønd) i medier (f.eks Dulbeccos modificerede Eagles eller DMEM-medium suppleret med 5% (v / v) føtalt bovint serum, 5% nyfødt kalveserum og penicillin (50 enheder / ml) plus streptomycin). </li></ol> 3.. Generering af virusstammer Fremstil VSV-G-pseudotype HIV ved transfektion af 293-celler (som vist i figur 1, trin 1) 32-34. <ol><li> På dagen før transfektion, plade 293 celler på 100 retter mm i diameter med en tæthed på 1,5 x 10 6 celler. </li><li> På dagen for transfektion transficere 293-celler med 16 ug af vildtype eller mutant HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) og 4 ug VSV (pHCMV-g) ved anvendelse af calciumphosphat-metoden 35. </li><li> Ca. 6 timer efter calciumphosphatpræcipitat tilsættes vaske 293-celler to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og inkuberes med frisk medium i 48 timer. [DMEM suppleret med 5% (v / v) føtalt bovint serum, 5% nyfødt kalveserum og penicillin (50 enheder / ml) plus streptomycin (50 ug / ml)]. </li><li> Harvest virus indeholdende supernatanter ved at fjerne mediet fra en diameter på 100 mmfade, klarlægge supernatanter ved lav hastighed centrifugering ved 3.000 rpm i 10 min, filtrere supernatanterne gennem en 45 um porestørrelse sprøjte filter, behandle supernatanterne med Turbo DNase i 30 min ved RT og fortyndes supernatanterne i medier til forberedelse i infektion assays . Opbevar de virale supernatanter frosne i alikvoter ved -80 ° C. Bemærk: mængden af ​​p24 i supernatanten bestemmes ved hjælp af en HIV-1 p24 enzymmaerket assay kit. Koncentrationen af ​​p24 anvendes til at styre mængden af ​​virus i prøven. Ca. 500 ng af virus tilsættes til Hos celler udpladet på skåle med en diameter på 60 mm ved en densitet på 1,5 x 10 5 celler / skål på dagen før infektion. Efter en 48 timers inkubation høstes cellerne opsamlet ved centrifugering, vasket og resuspenderet i 100 pi PBS. Tilføj en lige mængde Luminescence reportergenassay reagens og måle luciferaseaktivitet som beskrevet i afsnit 5.4.1 og5.4.2. Fra denne kan en passende fortynding af virus fremstillet som beskrevet i trin 4.6. </li></ol> 4.. Forbindelse Screening i 96-brønds plader Screen hver forbindelse i tre eksemplarer og gennemsnittet af resultaterne. Bemærk: virkningen af ​​hver forbindelse på viral replikation er korrigeret ved at normalisere til niveauet for replikation opnås i fravær af enhver forbindelse. <ol><li> Bestem empirisk koncentrationsområde, der skal screenes. Bemærk: typisk er skærme med 11 serielle fortyndinger fremstilles ved at tilsætte forbindelsen til pladen søjle for søjle og skærme med 7 seriefortyndinger fremstilles ved tilsætning af forbindelsen række. Et tredobbelt sæt brønde skal reserveres til ingen sammensatte kontrol. Desuden skal en søjle eller en række forblive blank til at fungere som den negative / baggrund kontrol. Endelig, uanset om det er en cellulær cytotoksicitet eller infektivitet analysen vil diktere, hvis der tilsættes virus. </li><li> Forberedseriefortyndinger fra 20 mM stamopløsning. Koncentrationerne udvælges afhængigt empirisk bestemt koncentrationsområde, der skal testes (som vist i tabel 1). Forbered fortyndinger i medierne på 10x slutkoncentration ønskede, dvs hvis den endelige koncentration vil være 100 uM, lave en 1 mM arbejder materiel. Bemærk: forbindelser med IC 50 s over 5-10 uM er normalt ikke gode kandidater til udvikling af lægemidler. I de indledende assays tester vi forbindelserne kun mod WT vektor. Lovende forbindelser, der effektivt hindrer WT vektor derefter testet mod et panel af resistente mutanter. </li><li> Fjern de 96-brønds plader fra inkubatoren og tilføje seriefortyndinger af forbindelserne, der skal testes til brøndene i tre eksemplarer (som vist i figur 1, trin 2). Bemærk: volumen til brønden bør være 1/10 volumen af ​​den endelige koncentration. Således tilsættes 22 gl / brønd (slutvolumen pOST virus Desuden er 220 ul) for infektivitet assays. For cytotoksicitetsassays, tilsættes 11 ul / brønd (endelig volumen er 110 ul / brønd). </li><li> Returnere 96-brønds plader til inkubatoren. For en cellulær cytotoksicitet skærm, inkuberes de 96 brønde 48 timer ved 37 ° C og ingen yderligere manipulationer er nødvendige i protokol nr. 4: videre til protokol nr. 5 for infektivitet assays, fortsætte med at følge instruktionerne i protokol 4.. </li><li> Infektivitet assays. Fjern pladerne fra inkubatoren efter mindst 3 timers inkubation ved 37 ° C med forbindelserne, der skal analyseres. Bemærk: dette tillader forbindelsen at blive optaget af cellerne forud for infektion med HIV-vektoren. </li><li> Forbered en bestand fortynding af virus 33, 34 (normalt ca 1:3), der vil producere en luciferasesignal mellem 0,2-1,5 relative luciferase enheder (RLU&#39;er) i ubehandlede celler. En hel plade vil tage cirka 10 ml fortyndingted virus. Tilsæt 100 pi af virus til hver af brøndene, enten ved hjælp af en 8 eller 12 multikanalpipette. Tilsæt ikke virus til kontrolbrøndene negativ / baggrund. Retur pladerne til 37 ° C inkubator i 48 timer. Bemærk: en 1:3-lager fortynding af virus er typisk fortynding, vil producere en luciferasesignal mellem 0,2 -1.5 RLU&#39;er baseret på en p24-assay viser, at den virale koncentrationen i supernatanten er ca 500 ng i 1,0 ml. </li></ol> 5.. Forberedelse og Måling af cytotoksicitet og smitteevne i 96-brønds plader <ol><li> Aspirer mediet fra brøndene (phenol rød i medierne kan forstyrre luciferasesignal). Brug en glaspipette med en 200 ul pipettespids fastgjort til enden. Start på toppen af ​​medierne og langsomt arbejde ned mod det nederste hjørne af brønden. Må ikke bruge for meget tid på bunden af ​​brønden, eller celler kan fjernes fra brønden. </li><li> Tilsæt 100 pi PBS suppleret med 0,5 mM MgCl2 til hver brønd. Dette skal ske umiddelbart efter fjernes mediet, således at cellerne ikke tørre ud. </li><li> Kun for cytotoksicitetsassays, tilsættes 5 ml substratbuffer fra Luminescence ATP detektionsassayet til hvert hætteglas med medfølgende frysetørrede reagens. Et hætteglas er tilstrækkeligt til en 96-brønds plade. <ol><li> Der tilsættes 50 ul af cellelyse-buffer fra Luminescence ATP-assay til hver brønd. Ryst 96-brønds plade ved 700 rpm ved stuetemperatur i 5 minutter under anvendelse af en kompakt Thermomixer. </li><li> Tilsæt 50 ul af rekonstitueret Luminescence ATP afsløring analysereagenskit til alle huller bortset for de negative kontrol / baggrund brønde. Ryst ved 700 rpm ved stuetemperatur i 5 minutter under anvendelse af en kompakt Thermomixer. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 20 min for at give tid til signalet udvikling. </li><li> Læs 96-brønds plade under anvendelse af mikroplade-luminometer. Bemærk: Åbn Softmax Pro mikroplade luminometer program. Sørg luminometret er indstillet til at måle luminescence ved en følsomhed på 5 aflæsninger / brønd. </li></ol></li><li> Kun for infektivitet assays tilsættes 10 ml substratbuffer fra Luminescence reportergenanalysen til hvert hætteglas leveres frysetørrede reagens. Et hætteglas er tilstrækkeligt til hver plade med 96 brønde. <ol><li> Tilsæt 100 pi af rekonstitueret Luminescence reportergeneassay reagens til hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 20 min for at give tid til signalet udvikling. </li><li> Læs plade med 96 brønde under anvendelse af en mikroplade luminometer som udføres i afsnit 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6.. Bestemmelse af CC 50 og IC 50 værdier for forbindelser <ol><li> Overfør luciferase data fra mikropladen luminometret i et Excel-regneark. <ol><li> Gennemsnitlig både luciferase data i tre eksemplarer og baggrunden / styresignalkilder data. Fratræk den gennemsnitlige baggrund / styresignal fra gennemsnittet tredobbelt signal for hele koncentrationsområde. </li> &lt;li&gt; Normalisere baggrund korrigeret gennemsnitlige signal til koncentrationsintervaller mod aktivitet, uanset om det er cytotoksicitet eller infektivitet, i fravær af enhver forbindelse, for at bestemme procent hæmning. Bemærk: procent hæmning er defineret som luciferaseaktiviteten i nærvær af lægemiddel divideret med luciferaseaktiviteten i fravær af lægemiddel multipliceret med 100. </li></ol></li><li> Brug Kaleidagraph software program til at opnå CC 50 og IC 50 værdier <ol><li> Overfør både empirisk bestemt koncentrationsområde og procent inhibering af luciferaseaktivitet i Kaleidagraph. </li><li> Plot data med det koncentrationsområde på x-aksen, og den procentvise inhibering af luciferaseaktivitet på y-aksen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Vi beskriver en hurtig, effektiv og reproducerbar assay, der kan anvendes til screening af forbindelser for cytotoksicitet og for deres evne til at inhibere replikation af både WT og resistente HIV-1-lægemiddel. Evnen til hurtigt at identificere forbindelser og teste deres effektivitet og cytotoksicitet er afgørende for udviklingen af ​​nye og forbedrede lægemidler mod HIV-1. Når blyforbindelser er identificeret, kan analoger af den ledende forbindelse fremstilles og testes under anvendelse af det samme assay. Assayet er forholdsvis enkel. Der er både positive og negative kontroller, der tillader brugeren at diagnosticere de mest almindelige problemer (giftige forbindelser, problemer med vektorpopulation). Anvendelsen af ​​en tredobbelt sæt brønde uden tilsat forbindelse viser, at der er opstået virusinfektion. Det faktum, at cytotoksicitet måles i en uafhængig analyse undgår misfortolker en reduktion i luciferase forårsaget af cytotoksicitet som en særlig effekt på viral replikation. De kritiske trini protokollen, er fremstilling af plader, således at cellerne er ensartet fordelt i brøndene, at fordybningerne har de rette koncentrationer af forbindelserne, der skal testes, tilføjer den samme mængde af virus til hver af brøndene, og måling af luciferaseaktiviteten til bestemme CC 50 og IC50-værdier. Assayet er sikkert, kvantitativ og reproducerbar. Assayet er sikkert, fordi vektoren er replikationsdefekt. Assayet er kvantitativ og reproducerbar, da det er baseret på en enkelt runde vektor, der udtrykker luciferase, der kan analyseres nøjagtigt og bekvemt. I et multi runde virusreplikation assay målte IC50 afhænger af antallet af virale livscyklus; dette er et særligt problem, når assays involverer både WT og resistente virus, der kan have markant forskellige replikation kapacitet. Der har været flere enzymatiske assays tidligere rapporteret, der kanbruges til at screene for IN-hæmmere. Assays, der involverer real time PCR teknologi til at måle en integreret DNA kræver oprensede rekombinante proteiner (r), og er generelt både mere arbejdskrævende og dyrt 36, 37. Selv om det er muligt at anvende enzymatiske assays til at måle virkningen af ​​forbindelserne på de andre virale enzymer (RT og protease), hvert enzym kræver sin egen assaysystem. Den ene runde vektor assay som beskrevet, kan anvendes uden modifikation til at screene for RT-inhibitorer. En lignende analyse kan anvendes til at screene for proteaseinhibitorer; men i en proteasehæmmer assay forbindelserne skal føjes til de celler, der anvendes til fremstilling af vektorerne. En beslægtet assay ved hjælp af forskellige celler og vektorer, kan også anvendes til at screene for kuvert (env) eller HIV entry fusion inhibitorer. Endelig kan assayet anvendes på en større skala med automatiserede robot dispensere. Således kan assayet anvendes til screening af store biblioteker af forbindelser mod WT og mutant HIV. Men det faktum, at analysen kan detektere en hæmmer af HIV-replikation, der virker på forskellige stadier af den virale livscyklus peger på en begrænsning i fortolkningen af ​​data. Ved selve analysen ikke definere, hvilke trin i livscyklus er blokeret af en forbindelse. Såfremt dette spørgsmål opstår, kan det løses ved hjælp af tidspunktet for tilsætning assays 38, og ved at teste forbindelsen mod oprensede rekombinante virale proteiner. Desværre, på trods af succesen af ​​anti hiv-medicin, er der stadig problemer med både modstand og toksicitet. I mangel af en effektiv anti HIV-vaccine, er der ikke blot behov for at udvikle nye terapeutiske lægemidler, der vil være effektiv mod de eksisterende resistente mutanter, men også for at udvikle forebyggende medicin, der kan reducere spredningen af ​​virus. Hvis profylaktisk brug af anti hiv-medicin incudes behandling af inficerede mennesker, vil denne tilgang placerer en særlig byrde for at udvikle lægemidler, der har little eller nogen langsigtet toksicitet.

Tilgængeligheden af ​​lægemidler rettet mod flere væsentlige trin i HIV-1-virus livscyklus har ført til medicinsk kombinationsbehandling (kaldet højaktiv anti retroviral behandling eller HAART), som har forbedret behandlingen af ​​HIV-1-infektioner, og den langsigtede overlevelse af patienterne. HAART, som typisk anvender kombinationer af to nukleosid revers transkriptase (RT-hæmmere) og enten en proteasehæmmer eller en non nukleosid RT-hæmmer, har nu konverteret en dødelig sygdom ind i en livslang tilstand 1-5. , På trods af de mange succeser HAART i vedvarende undertrykkelse af viral replikation, Men det har begrænsninger. HAART ikke udrydde HIV, så patienterne ikke helbredes, og terapi er livslang. Der er problemer med narkotika toksicitet og med fremkomsten af ​​resistente narkotika stammer. Resistens kan opstå på alle de godkendte anti HIV lægemidler, herunder de nyligt godkendte lægemidler, der er målrettet HIV integrase (IN). Lægemiddelresistens sandsynligvis opstår becabrug af spontane mutationer, der opstår under viral replikation (fejlprocent på 3 x 10 -5 mutationer / base / replikation cyklus) 6.. Når mutationer opstår i gener, der koder for mål for anti retroviral medicin, vil en lille delmængde af disse mutationer fører til en reduktion i følsomhed for den virale stamme til narkotika. For at undgå udvikling af resistens må medikamentkoncentrationer holdes på et niveau, der fuldt undertrykke HIV replikation. Dårlig vedhæftning til det terapeutiske regime forværrer problemet, og kan føre til den hurtige udvikling af resistens 7-9. Selv medikamentkoncentrationer kan variere i patienter på grund af forskellig absorption, metabolisme, fordeling og udskillelse niveauer, kan høje lægemiddelkoncentrationer føre til toksicitet 10. Da behandlingen fortsætter for livet af patienten, der er alvorlige sikkerhedsmæssige bekymringer på lang sigt toksicitet af anti retroviral medicin. Den anti retroviral medicin, der almindeligvis anvendes i HAART kan have negative virkninger ennd der har været hændelser, hvor bivirkningerne er livstruende 11-15. Problemerne patienter støder med udviklingen af ​​resistens og toksicitet ligger til grund for behovet for at udvikle nye lægemidler, der effektivt blokerer replikation af de fælles resistente stammer af viruset med ringe eller ingen langsigtet toksicitet. Der er således et behov for et assay, der kan screene for forbindelser, der blokerer vigtige skridt i den virale livscyklus hurtigt. Her beskriver vi en effektiv analyse, der kan anvendes til at evaluere cytotoksiciteten af ​​forbindelserne, og deres evne til at blokere replikation af både WT og lægemiddelresistente HIV-stammer hurtigt og effektivt. Analysen vi bruger svarer til et forsøg, der blev udviklet til at screene for resistens i virus isoleret fra patienter 16-18. Selvom assayet kan anvendes uden modifikation til screening for forbindelser, der kan blokere HIV-revers-transkription, vil vi DescrIBE anvendelse af assayet til at evaluere inhibitorer. I er et essentielt viralt enzym, der indsætter det virale DNA i det cellulære genom 19. Selv om en række lovende inhibitorer udvikles, er hvoraf nogle i øjeblikket undergår kliniske forsøg, kun Isentress 20, 21 (også kendt som Raltegravir eller RAL) og senest, Elvitegravir (EVG) 22 og Dolutegravir (DTG) 23 har været godkendt af FDA. Disse forbindelser er aktive mod både HIV-B og ikke-B-undertyper i cellekultur og hos patienter 24, 25. Men vælger behandling med RAL for multiresistent hiv-1 IN mutanter, herunder Y143R, N155H og G140S/Q148H 24. 26-31. N155H og G140S/Q148H også reducere effekten af ​​EVG, som understreger behovet for at designe og udvikle anden generation i Strand transfer-hæmmere (INSTIs), der er effektive mod disse resistente mutationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Selv om der er godkendt en række anti hiv-medicin, er der stadig problemer med toksicitet og resistens. Dette viser et behov for at identificere nye stoffer, som kan hæmme infektion med de fælles lægemiddelresistente HIV-1 stammer med minimal toksicitet. Her beskriver vi en effektiv analyse, der kan anvendes til hurtigt at bestemme den cellulære cytotoksicitet og effektiviteten af ​​en forbindelse over for WT og mutant-virusstammer. Det ønskede mål cellelinie udsået i en 96-brønds plade, og efter en 24 timers inkubation serielt fortyndinger af forbindelserne, der skal testes tilsættes. Ingen yderligere manipulationer der er nødvendige for cellulær cytotoksicitetsassays; for anti HIV-assays en forudbestemt mængde af enten en WT eller lægemiddelresistent HIV-1-vektor, som udtrykker luciferase tilsættes til cellerne. Cytotoksicitet måles ved hjælp af en ATP-afhængig luminescens assay og virkningen af ​​forbindelser på infektivitet måles ved at bestemme mængden af ​​lucifeRASE i nærvær eller fravær af de putative inhibitorer. Denne screening assay tager 4 dage at fuldføre og flere forbindelser kan screenes parallelt. Forbindelser screenes i tre eksemplarer og data er normaliseret til infektivitet / ATP i fravær af målforbindelserne. Denne teknik giver en hurtig og præcis måling af effekten og toksiciteten af ​​potentielle anti HIV forbindelser.

Hvis analysen (figur 1, trin 1 og 2) blev positivt resultat, så luciferase værdier skal ligne data præsenteret i tabel 2 Scan hele koncentrationsområde.; en potentielt potent forbindelse vil afsløre øget luciferaseaktivitet fra venstre til højre, og kontrollen skal have den højeste luciferaseaktivitet. Hvis Luciferaseaktiviteten ikke overstiger 0,1 Relative Luciferaseaktiviteter Units (RLU&#39;er) over det koncentrationsområde, indikerer dette, som regel, at den sammensatte dræbte cellerne. Hvis luciferase data er større end eller lig med 2,0 RLU&#39;er fra alle de serielle fortyndinger, så forbindelserne ikke var i stand til at hæmme HIV-1-infektioner i de testede koncentrationer. Plotte koncentrationen af forbindelserne i forhold til den procentvise inhibering af luciferaseaktivitet i Kaleidagraph (tabel 3, afsnit A), efter udførelse af lineær regressionsanalyse, vil producere lignende resultater t<html> slange vist i tabel 3, del B. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1.. Udarbejdelse af HIV-1-virus bestande og opsætning af cellemedieret cytotoksicitet og Single-runde Infektivitet Analyser. I trin 1 er 293T-celler transficeret med pNL4.3ΔEnv.LUC og VSV-G og inkuberes i 48 timer for at producere virus 34 . Virussen høstes og opbevares (frosset ved -80 ° C i portioner), indtil den anvendes i infektivitet assays. I trin 2 er Hos celler udsået i en 96-brønds plade og inkuberet i 24 timer. Cellerne præinkuberes med serielle fortyndinger af forbindelserne, der skal testes i 3 timer og derefter inficeret med virus (enten WT eller lægemiddelresistente). Efter en 48 timers inkubation luciferaseaktivitet målt. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabel 1.. Drug Screening seriefortynding Prototype. En mere stringent screening omfatter 11 seriefortyndinger der typisk starter ved 10 m og ender på 0,0005 uM. Seriefortyndingerne er forberedt 10x; Der er 100 ul celler og 100 pi af virus i hver brønd). På dette volumen og efter disse beregninger seriefortyndingerne være nok til 3 rækker af en hel plade med 96 brønde. De cytotoksicitetsassays fremstilles svarende; men de 11 seriefortyndinger starter på 250 pM og slutter ved 0,05 uM. Kun 11 ul af fortyndingerne tilsættes til brøndene i pladen, der indeholder 100 ul celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Tabel 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabel 2. Luciferasesignal data Aflæsning og Bestemmelse af procentvis inhibering af luciferaseaktivitet. Dataene tabel viser et typisk sæt luciferase data for en vellykket forbindelse. Tabellen viser også de ekstra beregninger, der er nødvendige for at bestemme procent hæmning af luciferaseaktivitet og CC 50 og IC 50 værdier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Tabel 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabel 3. Lineær regressionsanalyse Datatabel. Del A. Tegning af den anvendte koncentrationsområde versus procent inhibering af luciferaseaktivitet i Kaleidagraph vil producere passende inhiberingskurver. Del B, Inhiberingskurverne defineret af 3 parametriskesigmoidal funktion og pasform til de data, ved lineær regressionsanalyse 18. Denne datatabel derefter bruges sammen med Microsoft Excel til at beregne stofkoncentrationer, der kræves for at hæmme virus integration og cellulær cytotoksicitet med 50%, fx IC50 og CC50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Her beskriver vi cellulær cytotoksicitet og enkelt runde infektivitet analyser, som giver mulighed for hurtig og præcis screening af forbindelser for at bestemme deres cellulære cytotoksicitet (CC 50) og IC50-værdier mod WT og resistent HIV-1 lægemiddel.

Hurtig screening af HIV revers transkriptase og Integrase hæmmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating af HIV-1 kerner

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput Screening for Bredspektret Chemical hæmmere af RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-medieret Electrophoresis (NAME) Indhold Tillader hurtig identifikation af HIV-1 nucleocapsid inhibitorer

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System til Effekt og cytotoksicitet Screening af inhibitorer Målretning Intracellulær<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Fødevarebårne patogen Screening ved hjælp af Magneto-fluorescerende Nanosensor: Hurtig påvisning af E. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Registrering og fjernelse af nukleasen forurening under oprensning af rekombinante Prototype skummende Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...