Name: rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NCI unterstützt.

1. Vorbereitung der Master-Aktien <ol><li> Machen Master Aktien der in DMSO-Verbindungen getestet werden. Bereiten Aktien zu einem Standard-Konzentration von 20 mM. Hinweis: jede Konzentration oberhalb von 10 mm verwendet werden. Verbindungen, die als Positivkontrollen verwendet werden kann, um diesen Test zu validieren sind RAL-, EVG und DTG. </li><li> Sicherzustellen, dass die Verbindungen in DMSO durch Vortexen der Lösungen mehrmals für 15 sec und Inkubation bei RT für 1 h gelöst. Bewahren Sie die 20 mM Stammlösungen im Dunkeln bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Vorbereitung der 96-Well-Platten für Komponenten-Screening <ol><li> Wählen Sie die Zelllinie getestet werden (zB HOS oder TZM-bl) und Samen 100 ul dieser Zellen bei einer Dichte von 4 × 10 4 Zellen / ml (4000 Zellen / Vertiefung) in Medien (z. B. Dulbecco-modifiziertem Eagle-oder DMEM-Medium mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum, 5% Serum neugeborener Kälber, und Penicillin (50 Einheiten / ml) und Strept ergänztomycin). </li></ol> 3. Erzeugung von Virus-Stocks Erzeugen VSV-G-pseudotypisierten HIV-Zellen durch Transfektion 293 32-34 (wie in Fig. 1, Schritt 1). <ol><li> Am Tag vor der Transfektion Platte 293-Zellen auf 100 mm-Schalen in einer Dichte von 1,5 × 10 6 Zellen. </li><li> Am Tag der Transfektion, Transfektion von 293-Zellen mit 16 ug Wildtyp-oder mutierten HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) und 4 ug VSV (pHCMV-g) unter Verwendung der Calciumphosphat-Methode 35. </li><li> Etwa 6 Stunden nach der Calciumphosphat-Niederschlag wird aufgenommen, Wasch 293 Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Inkubation mit frischem Medium für 48 Stunden. [DMEM, ergänzt mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum, 5% Serum neugeborener Kälber, und Penicillin (50 Einheiten / ml) und Streptomycin (50 ug / ml)]. </li><li> Ernten Sie den Virus enthaltenden Überstände durch Entfernen der Medien aus dem 100 mm DurchmesserGeschirr, verdeutlichen die Überstände durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 3000 rpm für 10 min, die Überstände filtriert durch ein 45 &amp;mgr; m-Spritzenfilter Porengröße, Behandlung der Überstände mit Turbo DNase für 30 min bei RT inkubiert und die Überstände in verdünnten Medien für die Zubereitung in Infektionstests . Bewahren Sie die Virusüberstände eingefroren, aliquotiert, bei -80 ° C Anmerkung: Die Menge an p24 im Überstand wird mit einem HIV-1-p24-Enzym-Immunoassay-Kits bestimmt. Die p24-Konzentration verwendet wird, die Menge des Virus in der Probe zu steuern. Ungefähr 500 ng Virus zu HOS-Zellen auf 60 mm-Schalen plattiert bei einer Dichte von 1,5 x 10 5 Zellen / Schale am Tag vor der Infektion zugesetzt. Nach 48 h Inkubation werden die Zellen geerntet, durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in 100 &amp;mgr; l PBS resuspendiert. In die gleiche Menge an Lumineszenz Reporter-Gen-Assay-Reagenz und messen Luciferase-Aktivität wie in den Abschnitten 5.4.1 und5.4.2. Daraus kann eine geeignete Verdünnung des Virus, wie in Schritt 4.6 beschrieben werden. </li></ol> 4. Substanz-Screening in 96-Well-Platten Bildschirm jede Verbindung in dreifacher Ausfertigung und der Mittelwert der Ergebnisse. Hinweis: Die Wirkung jeder Verbindung auf die virale Replikation wird durch Normierung auf die Ebene der Replikation in Abwesenheit von Verbindung erhalten wird korrigiert. <ol><li> Bestimmen Sie die Summenkonzentrationsbereich zu sehen sein. Hinweis: in der Regel werden die Bildschirme mit 11 Reihenverdünnungen durch Zugabe der Verbindung zu der Platte Spalte für Spalte und Bildschirme mit sieben serielle Verdünnungen gemacht werden, indem die Verbindung von Zeile vorgenommen. Ein dreifacher Reihe von Brunnen muss für die Verbindung keine Steuer reserviert werden. Darüber hinaus muss eine Spalte oder eine Zeile leer bleiben als negativ / Hintergrundkontrolle handeln. Schließlich sei es eine zelluläre Zytotoxizität oder Infektiosität Assay wird diktieren, ob Virus zugegeben. </li><li> Vorbereitenserielle Verdünnungen von der 20 mM Stammlösung. Die Konzentrationen sind in Abhängigkeit von der empirisch ermittelten Bereich von zu testenden Konzentrationen gewählt (wie in Tabelle 1 gezeigt). Bereiten Sie die Verdünnungen in Medien bei 10x die gewünschte endgültige Konzentration, dh wenn die endgültige Konzentration wird bis 100 um, machen Sie eine 1 mM Arbeits Lager. Anmerkung: Verbindungen mit IC 50 s über 5-10 um üblicherweise nicht gute Kandidaten für die Wirkstoffentwicklung. In den ersten Tests prüfen wir die Verbindungen nur gegen den WT-Vektor. Vielversprechende Verbindungen, die effektiv hemmen die WT-Vektor werden dann gegen eine Auswahl von resistenten Mutanten getestet. </li><li> Entfernen der 96-Well-Platten aus dem Inkubator und fügen die serielle Verdünnungen der zu den Vertiefungen in dreifacher Ausführung getestet werden Verbindungen (wie in Fig. 1, Schritt 2 gezeigt). Hinweis: Der in die Vertiefung gegeben Volumen sollte 1/10 Volumen Endkonzentration sein. So fügen Sie 22 &amp;mgr; l / (Endvolumen pOST-Virus zusätzlich 220 ul) für die Infektiosität Assays. Für Zytotoxizitätsassays, fügen Sie 11 ul / (Endvolumen 110 ul / Vertiefung). </li><li> Geben die 96-Well-Platten in den Inkubator. Für eine zelluläre Zytotoxizität Bildschirm, brüten die 96-Well-Platten 48 h bei 37 ° C und keine weiteren Manipulationen werden in Protokoll Nr. 4 benötigt: gehen Sie zu Protokoll 5 Für Infektiosität Assays, folgen weiter den Anweisungen in Protokoll Nr. 4.. </li><li> Nur Infektiosität Assays. Entfernen der Platten aus dem Inkubator nach einem Minimum von 3 h Inkubation bei 37 ° C mit den Verbindungen zu analysieren. Anmerkung: Dies ermöglicht die Verbindung von den Zellen vor der Infektion mit dem HIV-Vektor aufgenommen werden. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnung der Lager-Virus 33, 34 (in der Regel ca. 01.03 Uhr), die eine Luciferase-Signal zwischen 0,2-1,5 relativen Luciferase-Einheiten (RLE) in unbehandelten Zellen produzieren wird. Eine ganze Platte wird ca. 10 ml Verdünnung nehmented-Virus. Füge 100 &amp;mgr; l Virus zu jeder der Vertiefungen, unter Verwendung von entweder 8 oder 12 Mehrkanalpipette. Sie Virus zu den negativen / Hintergrund-Kontrollvertiefungen nicht hinzu. Rückgabe der Platten an den 37 ° C-Inkubator für 48 Stunden. Hinweis: 1:3 Lager Verdünnung des Virus ist typisch Verdünnung, die eine Luciferase-Signal zwischen 0,2 -1,5 RLUs basierend auf einer p24-Test zeigt, dass die Viruskonzentration im Überstand beträgt ca. 500 ng in 1,0 ml produzieren wird. </li></ol> 5. Vorbereitung und Messung der Zytotoxizität und Infektiosität in 96-Well-Platten <ol><li> Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen (Phenolrot in den Medien mit der Luciferase-Signal stören). Verwenden Sie eine Glaspipette mit einer 200 ul Pipettenspitze bis zum Ende befestigt. Start an der Spitze der Medien und langsam arbeiten nach unten in Richtung der unteren Ecke des Brunnens. Zu viel Zeit verbringen Sie am unteren Rand des Brunnens, oder Zellen können aus dem Bohrloch entfernt werden. </li><li> 100 l PBS, ergänzt mit 0,5 mM MgCl 2 in jede Vertiefung. Dies muss unmittelbar erfolgen, nachdem das Medium entfernt, so dass die Zellen nicht austrocknen. </li><li> Nur für Zytotoxizitätsassays, 5 ml Substratpuffer von der ATP-Lumineszenz-Nachweistest zu jeder Flasche des gefriergetrockneten Reagenz geliefert. Ein Fläschchen für eine 96-Well-Platte aus. <ol><li> In 50 ul Zelllysepuffer von der ATP-Lumineszenz-Nachweistest in jede Vertiefung. Schütteln der Platte mit 96 Vertiefungen bei 700 Upm bei Raumtemperatur für 5 min unter Verwendung eines kompakten Thermomixer. </li><li> In 50 ul des rekonstituierten ATP Lumineszenz-Nachweis-Assay-Reagenz in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Negativkontrolle / Hintergrund-Brunnen. Schütteln bei 700 Upm bei Raumtemperatur für 5 min unter Verwendung eines kompakten Thermomixer. Die Platten bei RT für 20 Minuten inkubieren, um Zeit für Signalentwicklung zu ermöglichen. </li><li> Lesen Sie die 96-Well-Platte mit dem Mikroplatten-Luminometer. Hinweis: Öffnen Sie die SoftMax Pro Mikroplatten-Luminometer Programm. Stellen Sie sicher, das Luminometer Lumi ist zu messenzenz bei einer Empfindlichkeit von 5 Messwerten / gut. </li></ol></li><li> Nur für die Infektiosität Assays, 10 ml Substratpuffer von der Lumineszenz Reporter-Gen-Assay auf jeder Flasche des gefriergetrockneten Reagenz geliefert. Ein Fläschchen ist ausreichend für jede Platte mit 96 Vertiefungen. <ol><li> 100 l rekonstituiert Lumineszenz Reporter-Gen-Assay-Reagenz in jede Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min, um Zeit für Signalentwicklung ermöglichen. </li><li> Lesen Sie die 96-Well-Platte mit Hilfe eines Mikroplatten-Luminometer, wie in Abschnitt 5.3.3 durchgeführt. </li></ol></li></ol> 6. Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte für die Verbindungen <ol><li> Übertragen Sie die Daten aus der Luciferase-Mikroplatten-Luminometer in eine Excel-Tabelle. <ol><li> Durchschnittliche sowohl die Luciferase Daten in dreifacher Ausfertigung und Hintergrund / Steuerdaten. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hinter / Steuersignal von der dreifachen durchschnittlichen Signal für den gesamten Konzentrationsbereich. </li> &lt;li&gt; normalisieren die Hintergrund korrigierten mittleren Signal für die Konzentrationsbereiche gegen die Aktivität, ob es sich um Zytotoxizität oder Infektiosität in Abwesenheit irgendeiner Verbindung, um die prozentuale Inhibierung zu bestimmen. Hinweis: prozentuale Hemmung wird als die Luciferase-Aktivität in Anwesenheit von Arzneimittel in der Abwesenheit von Arzneimittel, multipliziert mit 100 geteilt durch die Luciferase-Aktivität bestimmt. </li></ol></li><li> Verwenden Kaleidagraph Software-Programm zu CC 50 und IC 50-Werte zu erhalten <ol><li> Übertragen Sie sowohl die empirisch ermittelten Konzentrationsbereich und prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph. </li><li> Zeichnen Sie die Daten mit dem Konzentrationsbereich auf der x-Achse und die prozentuale Inhibierung der Luciferase-Aktivität auf der y-Achse. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben eine schnelle, effiziente und reproduzierbare Assay zum Screening von Verbindungen, die für die Zytotoxizität und auf ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und arzneimittelresistenten HIV-1 hemmen, verwendet werden können. Die Fähigkeit, schnell Verbindungen zu identifizieren und prüfen ihre Wirksamkeit und Zytotoxizität bei der Entwicklung von neuen und verbesserten Arzneimitteln gegen HIV-1 wichtig. Sobald Bleiverbindungen identifiziert werden, können Analoga der Bleiverbindung hergestellt werden und unter Verwendung des gleichen Assays. Der Test ist relativ einfach. Es gibt sowohl positive und negative Kontrollen, die dem Benutzer die häufigsten Probleme (toxische Verbindungen, Probleme mit dem Vektor stock) Diagnose zu ermöglichen. Die Verwendung eines Dreifachsatzes von Vertiefungen ohne zugesetzte Verbindung zeigt, dass die Virusinfektion aufgetreten. Die Tatsache, dass die Cytotoxizität in einem unabhängigen Test gemessen vermeidet Fehlinterpretation einer Verringerung der Luciferase von Zytotoxizität als eine spezifische Wirkung auf die virale Replikation verursacht werden. Die kritischen Schrittein dem Protokoll werden die Platten vorbereitet, so dass die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sind, daß die Bohrungen über die entsprechenden Konzentrationen der zu prüfenden Verbindungen, indem die gleiche Menge an Virus zu jeder der Vertiefungen, und die Messung der Luciferase-Aktivität Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte. Der Test ist sicher, quantitative und reproduzierbar. Der Test ist sicher, weil der Vektor-Replikation defekt. Der Test ist quantitativ und reproduzierbar, da sie auf einer einzigen Runde Vektor, der Luciferase exprimiert, die genau und bequem untersucht werden kann, nach. In einer mehrjährig Virusreplikation Assay wird die gemessene IC 50 hängt von der Anzahl der viralen Lebenszyklen; dies ist ein besonderes Problem, wenn die Tests umfassen sowohl WT und resistenten Viren, die deutlich unterschiedliche Replikations Kapazitäten haben können. Es wurden mehrere enzymatische Tests zuvor berichtet, dassverwendet werden, um an Inhibitoren screenen. Assays, die Echtzeit-PCR-Technologie beinhalten, um integrierte DNA messen erfordern gereinigt rekombinante Proteine ​​(e) und sind in der Regel sowohl arbeitsintensiv und teuer 36, 37. Obwohl es möglich ist, die enzymatische Assays verwenden, um die Wirkung der Verbindungen auf die andere virale Enzyme (RT und Protease) zu messen, wobei jedes Enzym erfordert eine eigene Testsystem. Die eine Runde Vektor-Assay wie beschrieben, kann verwendet werden, ohne Änderung an für RT-Inhibitoren zu screenen. Ein ähnlicher Test kann verwendet werden, um Protease-Inhibitoren zu screenen; jedoch in einem Protease-Inhibitor-Assay, die Verbindungen müssen auf die die Vektoren verwendet Zellen hinzugefügt werden. Eine verwandte Assay mit verschiedenen Zellen und Vektoren können auch verwendet werden, um Umschlag (env) und das Eindringen von HIV-Fusionsinhibitoren screenen. Schließlich kann der Assay verwendet werden, in einem größeren Maßstab, mit automatisierten Roboterspendern. So kann der Assay verwendet werden, um große Bibliotheken von Verbindungen gegen WT und m screenenutant HIV. Die Tatsache jedoch, kann der Assay einen Inhibitor der HIV-Replikation, die in verschiedenen Stadien des viralen Lebenszyklus weist auf eine Beschränkung in der Interpretation der Daten wirkt, zu erfassen. Von selbst der Test wird nicht definiert, welcher Schritt im Lebenszyklus durch eine Verbindung blockiert. Wenn diese Frage stellt, kann es durch Verwendung der Zeit des Assays zusätzlich 38 gelöst werden, und durch Testen der Verbindung gegen gereinigten rekombinanten viralen Proteinen. Leider trotz des Erfolgs der Anti-HIV-Arzneimittel, gibt es immer noch Probleme mit sowohl Beständigkeit und Toxizität. In Abwesenheit einer wirksamen Anti-HIV-Impfstoff, ist es notwendig, nicht nur neue therapeutische Arzneimittel, die wirksam sein werden anhand der vorhandenen Arzneimittel-resistenten Mutanten, sondern auch zu prophylaktischen Medikamente, die die Ausbreitung des Virus zu reduzieren entwickeln zu entwickeln. Wenn die prophylaktische Anwendung von Anti-HIV-Medikamente incudes die Behandlung von nicht-infizierten Menschen wird dieser Ansatz eine besondere Belastung für die Entwicklung von Medikamenten, haben l sind platzierenittle oder keine langfristige Toxizität.

Die Verfügbarkeit von Medikamenten, die an einige wesentliche Schritte in der HIV-1 viralen Lebenszyklus zu Kombinationstherapie (so genannte hochaktive antiretrovirale Therapie oder HAART), die sich stark verbessert hat die Behandlung von HIV-1-Infektionen, und die langfristige Überlebensrate geführt der Patienten. HAART, die typischerweise verwendet Kombinationen von zwei Nukleosid-Reverse-Transkriptase-(RT)-Hemmer und entweder ein Protease-Inhibitor oder ein Nicht-Nukleosid-RT-Hemmer, wurde jetzt eine tödliche Krankheit umgewandelt in ein Leben lang Zustand 1-5. Trotz der vielen Erfolge von HAART in verzögerter Unterdrückung der Virusreplikation, hat es jedoch Einschränkungen. HAART nicht auszurotten HIV, so dass die Patienten nicht geheilt und Therapie ist das Leben lang. Es gibt Probleme mit Medikamententoxizität und mit der Entstehung von resistenten Sorten. Widerstand kann auf alle zugelassenen Anti-HIV-Medikamente, einschließlich der neu zugelassenen Medikamente, die HIV-Integrase (IN) Ziel kommen. Arzneimittelresistenz entsteht wahrscheinlich becaVerwendung von spontanen Mutationen, die während der viralen Replikation (Fehlerrate von 3 x 10 -5 Mutationen / base / Replikationszyklus) auftreten 6. Wenn Mutationen entstehen in den Genen, die für die Ziele der Anti retrovirale Medikamente codiert, wird eine kleine Teilmenge dieser Mutationen zu einer Verringerung der Empfindlichkeit des Virusstammes, um die Medikamente führen. Um die Entwicklung von Resistenzen zu vermeiden, muss Wirkstoffkonzentrationen auf einem Niveau, das die HIV-Replikation vollständig zu unterdrücken, aufrecht erhalten werden. Schlechte Einhaltung der Therapieregime verschärft das Problem, und kann auf die schnelle Entwicklung von Resistenzen führen 7-9. Obwohl Wirkstoffkonzentrationen bei Patienten aufgrund unterschiedlicher Resorption, Stoffwechsel, Verteilung und Ausscheidung Ebenen variieren können hohe Wirkstoffkonzentrationen, um die Toxizität 10 führen. Seit Therapie weiterhin für das Leben des Patienten, gibt es ernsthafte Sicherheitsbedenken hinsichtlich der langfristigen Toxizität von Antiretroviren. Die antiretrovirale Medikamente häufig in HAART verwendet werden, können negative Auswirkungen haben einnd gab es Fälle, wo die Nebenwirkungen wurden lebensbedrohlich 11-15. Die Probleme, die Patienten stoßen mit der Entwicklung von Widerstand und Toxizität zugrunde liegen, die Notwendigkeit, neue Medikamente, die die Replikation der gemeinsamen resistenten Stämme des Virus mit wenig oder keine langfristige Toxizität effektiv blockieren zu entwickeln. Somit besteht ein Bedarf an einem Assay, der für die Verbindungen, die wesentlichen Schritte schnell blockieren im viralen Lebenszyklus zu screenen kann. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um die Zytotoxizität der Verbindungen A und ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und Arzneimittel-resistente HIV-Stämme schnell und effizient zu blockieren auszuwerten. Der Test wir verwenden, ist ähnlich zu einem Test, der entwickelt wurde, um für eine Arzneimittelresistenz in Virus aus Patienten isoliert 16-18 screenen. Obwohl der Test kann ohne Modifikation zum Screening auf Verbindungen, die HIV reverse Transkription blockieren kann verwendet werden, werden wir describe mit dem Test zu bewerten, IN-Inhibitoren. IN ist ein essentielles virales Enzym, das die virale DNA in das zelluläre Genom 19 einfügt. Obwohl eine Reihe von vielversprechenden IN Inhibitoren entwickelt werden, von denen einige derzeit in klinischen Studien nur Isentress 20, 21 (auch als Raltegravir oder RAL bekannt) und in jüngerer Zeit, Elvitegravir (EVG) 22 und Dolutegravir (DTG) 23 wurden von der FDA zugelassen. Diese Verbindungen sind sowohl gegen HIV-B-B-Subtypen und nicht in Zellkultur und in Patienten 24, 25 aktiv. Die Behandlung mit RAL wählt für Arzneimittel-resistente HIV-1-IN-Mutanten, einschließlich Y143R, N155H und G140S/Q148H 24, 26-31. N155H G140S/Q148H und reduzieren auch die Wirksamkeit von EVG, die die Notwendigkeit, IN Strangtransfer-Inhibitoren (INSTIs), die wirksam gegen diese Resistenz-Mutationen sind Design und Entwicklung der zweiten Generation betont.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Obwohl eine Reihe von Anti-HIV-Arzneimittel genehmigt wurden, gibt es immer noch Probleme mit der Toxizität und Medikamentenresistenz. Dies zeigt die Notwendigkeit, neue Verbindungen, die Infektion durch die gemeinsame arzneimittelresistenten HIV-1-Stämme mit minimaler Toxizität hemmen kann, zu identifizieren. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um schnell zu bestimmen, die zelluläre Zytotoxizität und Wirksamkeit einer Verbindung gegen WT und Mutanten-Virusstämme. Die gewünschte Zielzelllinie wird in 96-Well-Platte ausgesät und nach 24 Stunden Inkubation werden seriell Verdünnungen der zu testenden Verbindungen zugegeben. Keine weitere Manipulationen sind für zelluläre Zytotoxizität-Tests erforderlich; für Anti-HIV-Tests eine vorbestimmte Menge von entweder einer WT oder arzneimittelresistenten HIV-1-Vektor, der Luciferase zu den Zellen gegeben drückt. Zytotoxizität wird unter Verwendung eines ATP-abhängige Lumineszenz-Assay und die Wirkung der Verbindungen auf die Infektiosität gemessen wird durch Bestimmen der Menge des gemessenen luciferase in Gegenwart oder Abwesenheit des mutmaßlichen Inhibitoren. Diese Screening-Test dauert 4 Tage dauern und mehrere Verbindungen parallel untersucht werden. Verbindungen werden dreifach durchmustert, und die Daten sind auf die Infektiosität / ATP-Spiegel in Abwesenheit von Zielverbindungen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und genaue Messung der Wirksamkeit und Toxizität von potentiellen Anti-HIV-Verbindungen.

Wenn der Test (Fig. 1, Schritte 1 und 2) wurde erfolgreich durchgeführt, dann sollte die Luciferase-Werte, die in Tabelle 2 präsentierten Daten ähneln Scannen über den Konzentrationsbereich. eine potenziell starke Verbindung wird zeigen zunehmende Luciferase-Aktivität von links nach rechts, und die Steuerung sollte die höchste Luciferase-Aktivität zu haben. Wenn die Luciferase-Aktivität hat 0,1 Relative Luciferase-Einheiten (RLE) über den Konzentrationsbereich nicht überschreiten, dies in der Regel an, dass die Verbindung der Zellen getötet. Wenn die Luciferase Daten größer als oder gleich 2,0 RLU für alle Serienverdünnungen, dann wurden die Verbindungen nicht in der Lage, HIV-1-Infektionen bei den getesteten Konzentrationen zu inhibieren. Auftragen der Konzentration der Verbindungen im Vergleich zu der prozentualen Inhibition der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph (Tabelle 3, Teil A), nach dem Durchführen einer linearen Regressionsanalyse, werden ähnliche Ergebnisse zu produzieren t<html> Schlauch in Tabelle 3, Teil B gezeigt <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Vorbereitung der HIV-1-Virus-Stocks und dem Aufbau der zelluläre Zytotoxizität und Single-Runde Infektiosität Assays. In Schritt 1 293T-Zellen mit pNL4.3ΔEnv.LUC und VSV-G transfiziert und für 48 Stunden inkubiert, um die Virus-34 produzieren . Das Virus wird geerntet und gelagert (bei -80 ° C in Aliquots eingefroren), bis er in die Infektiosität-Assays verwendet wird. Für Schritt 2 werden HOS-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und 24 h lang inkubiert. Die Zellen werden dann mit seriellen Verdünnungen der für 3 Stunden getestet werden Verbindungen vorinkubiert und dann mit Virus (entweder WT oder resistenten) infiziert. Nach einer 48-stündigen Inkubation wird die Luciferase-Aktivität gemessen. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabelle 1. Drug Screening Verdünnungs Prototype. Eine strengere Screening beinhaltet 11 Verdünnungsreihen, die in der Regel beginnen bei 10 uM und endet um 0,0005 uM. Die serielle Verdünnungen vorbereitet 10x; es gibt 100 ul Zellen und 100 &amp;mgr; l Virus pro Vertiefung). In diesem Volumen und nach diesen Berechnungen werden die seriellen Verdünnungen genug für 3 Zeilen eines gesamten 96-Well-Platte sein. Die Zytotoxizität-Tests werden auf ähnliche Weise hergestellt; aber die 11 serielle Verdünnungen beginnen bei 250 uM und am Ende bei 0,05 uM. Nur 11 ul der Verdünnungen werden in die Vertiefungen in der Platte, die 100 ul Zellen enthalten aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabelle 2. Luciferase-Signal Datenauslesung und Bestimmung der prozentualen Inhibition der Luciferase-Aktivität. Die Datentabelle zeigt einen typischen Satz von Luciferase-Daten für eine erfolgreiche Verbindung. Die Tabelle zeigt auch die weiteren Berechnungen erforderlich, um die prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität und die CC-50 und IC 50-Werte zu bestimmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabelle 3. Lineare Regressionsanalyse Datentabelle. Teil A. Grafische Darstellung der Konzentrationsbereich gegenüber der prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph verwendet wird die entsprechenden Hemmkurven zu produzieren. Teil B, Die Hemmung Kurven durch die parametrische 3 definiertsigmoidale Funktion und Passform auf den Daten, die von linearen Regressionsanalysen 18. Diese Daten-Tabelle wird dann in Verbindung mit Microsoft Excel verwendet, um die Wirkstoffkonzentrationen erforderlich, um Virus-Integration und zelluläre Zytotoxizität von 50%, zB IC 50 und CC 50 hemmen berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...