Name: rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00
Duration: 5 min 46 s
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	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

हम cytotoxicity के लिए और गुम्मट और दवा एचआईवी -1 प्रतिरोधी दोनों की प्रतिकृति को बाधित करने की क्षमता के लिए स्क्रीन यौगिकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक त्वरित, कुशल, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परख का वर्णन. जल्दी यौगिकों की पहचान और उनकी प्रभावकारिता और cytotoxicity का परीक्षण करने की क्षमता एचआईवी -1 के खिलाफ नए और बेहतर दवाओं के विकास में महत्वपूर्ण है. नेतृत्व यौगिकों की पहचान हो जाने के बाद, नेतृत्व परिसर के अनुरूप उत्पादन किया है और एक ही परख का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है. परख अपेक्षाकृत सरल है. उपयोगकर्ता सबसे आम समस्याओं (विषाक्त यौगिकों, वेक्टर स्टॉक के साथ समस्याओं) का निदान करने की अनुमति है कि दोनों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं. कोई गयी परिसर के साथ कुओं की तीन प्रतियों सेट का उपयोग वायरल संक्रमण हो गई है कि पता चलता है. cytotoxicity एक स्वतंत्र परख में मापा जाता है तथ्य यह है कि वायरल प्रतिकृति पर एक विशेष प्रभाव के रूप में cytotoxicity के कारण luciferase में कमी बदल बचा जाता है. महत्वपूर्ण कदमकोशिकाओं समान रूप से कुओं में से प्रत्येक के लिए वायरस का एक ही राशि जोड़ने के लिए, और luciferase गतिविधि को मापने, कुओं परीक्षण किया जाना यौगिकों की उचित सांद्रता है कि, कुओं में वितरित कर रहे हैं इतना है कि प्रोटोकॉल में प्लेटें तैयारी कर रहे हैं सीसी 50 और आईसी 50 मूल्यों का निर्धारण. परख, सुरक्षित मात्रात्मक, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. वेक्टर प्रतिकृति दोषपूर्ण है क्योंकि परख सुरक्षित है. यह सही है और आसानी से assayed किया जा सकता है जो luciferase व्यक्त करता है कि एक दौर वेक्टर, पर आधारित है क्योंकि परख मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. एक बहु दौर वायरस नकल परख में, मापा आईसी 50 वायरल जीवन चक्र की संख्या पर निर्भर करता है; assays के गुम्मट और काफी अलग प्रतिकृति क्षमता हो सकता है कि दवा प्रतिरोधी वायरस दोनों को शामिल करते हैं तो यह एक विशेष समस्या है. कई एंजाइमी assays कर सकते हैं कि वहाँ पहले सूचित किया गया हैमें inhibitors के लिए स्क्रीन इस्तेमाल किया जा. एकीकृत डीएनए को मापने के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रौद्योगिकी को शामिल assays अधिक श्रम गहन और 36, 37 महंगा दोनों, शुद्ध पुनः संयोजक प्रोटीन (ओं) की आवश्यकता होती है, और सामान्य रूप में, कर रहे हैं. यह अन्य वायरल एंजाइमों (आर टी और प्रोटीज) पर यौगिकों के प्रभाव को मापने के लिए enzymatic assays का उपयोग करने के लिए संभव है, प्रत्येक एंजाइम का अपना परख प्रणाली की आवश्यकता है. एक दौर वेक्टर परख, वर्णित के रूप में, आरटी inhibitors के लिए स्क्रीन के लिए, संशोधन के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसा ही एक परख protease inhibitors के लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, एक protease अवरोध परख में, यौगिकों वैक्टर का उत्पादन किया जाता कोशिकाओं को जोड़ा जाना चाहिए. एक संबंधित परख, विभिन्न कोशिकाओं और वैक्टर का उपयोग, भी लिफाफा (लि) और एचआईवी प्रवेश संलयन inhibitors के लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्त में, परख स्वचालित रोबोट dispensers के साथ, एक बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, परख WT और एम के खिलाफ यौगिकों के बड़े पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैutant एचआईवी. हालांकि, इस तथ्य परख डेटा की व्याख्या में एक सीमा तक वायरल जीवन चक्र अंक के विभिन्न चरणों में कार्य करता है कि एचआईवी प्रतिकृति के एक अवरोध का पता लगा सकते. अपने आप से परख जीवन चक्र में कदम एक यौगिक द्वारा अवरुद्ध है जो परिभाषित नहीं करता है. इस सवाल उठता है, यह इसके अलावा assays 38 के समय का उपयोग करके हल, और शुद्ध पुनः संयोजक वायरल प्रोटीन के खिलाफ यौगिक परीक्षण के द्वारा किया जा सकता है. दुर्भाग्य से, विरोधी एचआईवी दवाओं की सफलता के बावजूद, प्रतिरोध और विषाक्तता दोनों के साथ समस्या अभी भी वहाँ हैं. एक प्रभावी विरोधी एचआईवी टीके के अभाव में मौजूदा दवा प्रतिरोधी म्यूटेंट के खिलाफ प्रभावी हो जाएगा, लेकिन यह भी वायरस के प्रसार को कम कर सकते हैं कि रोगनिरोधी दवाओं को विकसित करने के लिए कि नई चिकित्सकीय दवाओं के विकास के लिए न केवल एक की जरूरत है. विरोधी एचआईवी दवाओं के रोगनिरोधी उपयोग असंक्रमित लोगों का उपचार incudes हैं, इस दृष्टिकोण एल हैं कि दवाओं के विकास पर एक विशेष बोझ जगह होगीittle या कोई दीर्घकालिक विषाक्तता.

एचआईवी -1 वायरल जीवन चक्र में कई आवश्यक कदम को लक्षित दवाओं की उपलब्धता बहुत एचआईवी -1 संक्रमण के उपचार, और लंबे समय तक जीवित रहने में सुधार हुआ है कि संयोजन ड्रग थेरेपी (अत्यधिक सक्रिय एंटी रेट्रोवायरल थेरेपी कहा जाता है, या एचएएआरटी) के लिए प्रेरित किया रोगियों की. आम तौर पर दो न्यूक्लीओसाइड रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) inhibitors और एक protease अवरोध या एक गैर न्यूक्लीओसाइड आरटी अवरोध करनेवाला या तो के संयोजन का उपयोग करता है जो एचएएआरटी,, अब जीवन भर हालत 1-5 में एक घातक बीमारी परिवर्तित किया गया है. हालांकि, वायरल प्रतिकृति के निरंतर दमन में HAART के कई सफलताओं के बावजूद, यह सीमाएँ हैं. HAART एचआईवी उन्मूलन नहीं करता है, तो रोगियों को ठीक नहीं कर रहे हैं और चिकित्सा के जीवन लंबा है. दवा विषाक्तता के साथ और दवा प्रतिरोधी उपभेदों के उद्भव के साथ समस्याएं हैं. प्रतिरोध एचआईवी इंटिग्रेस (IN) को लक्षित कि नव स्वीकृत दवाओं सहित अनुमोदित विरोधी एचआईवी दवाओं, सब के लिए पैदा कर सकते हैं. ड्रग प्रतिरोध की संभावना beca उठतावायरल प्रतिकृति (3 एक्स 10 -5 म्यूटेशन / आधार / प्रतिकृति चक्र की त्रुटि दर) के दौरान होने वाले सहज परिवर्तन का उपयोग 6. म्यूटेशन एंटी रेट्रोवायरल दवाओं के लक्ष्य के लिए कोडिंग जीन में उत्पन्न होती हैं, तो ये परिवर्तन के एक छोटे सबसेट दवाओं को वायरल तनाव की संवेदनशीलता में कमी करने के लिए नेतृत्व करेंगे. दवा प्रतिरोध के विकास से बचने के लिए दवा सांद्रता पूरी तरह से एचआईवी प्रतिकृति को दबाने कि स्तरों पर बनाए रखा जाना चाहिए. चिकित्सकीय आहार के लिए गरीब पालन समस्या exacerbates, और प्रतिरोध 7-9 के तेजी से विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दवा सांद्रता के कारण भिन्न अवशोषण, चयापचय, वितरण, और उत्सर्जन के स्तर को रोगियों में भिन्न हो सकते हैं, उच्च दवा सांद्रता विषाक्तता 10 हो सकती है. चिकित्सा रोगी के जीवन के लिए जारी है के बाद से, विरोधी रेट्रोवायरल की दीर्घकालिक विषाक्तता के बारे में गंभीर सुरक्षा चिंताएं हैं. सामान्यतः एचएएआरटी में इस्तेमाल किया विरोधी रेट्रोवायरल प्रतिकूल प्रभाव हो सकता है एकएन डी दुष्प्रभाव जीवन 11-15 की धमकी दे रहा है जहां घटनाओं किया गया है. रोगियों प्रतिरोध और विषाक्तता के विकास के साथ मुठभेड़ की समस्याओं को प्रभावी ढंग से कम या कोई दीर्घकालिक विषाक्तता के साथ वायरस के आम दवा प्रतिरोधी उपभेदों की प्रतिकृति ब्लॉक कि नई दवाओं को विकसित करने की जरूरत को कायम करना. इस प्रकार, जल्दी वायरल जीवन चक्र में आवश्यक कदम है कि ब्लॉक यौगिकों के लिए स्क्रीन कर सकते हैं कि एक परख के लिए एक की जरूरत है. यहाँ हम एक यौगिकों और तेजी से और कुशलता से WT और दवा प्रतिरोधी एचआईवी उपभेदों दोनों की प्रतिकृति ब्लॉक करने की क्षमता के cytotoxicity का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कुशल परख का वर्णन. हम उपयोग परख रोगियों 16-18 से अलग वायरस में दवा प्रतिरोध के लिए स्क्रीन करने के लिए विकसित किया गया था कि एक परख करने के लिए इसी तरह की है. परख एचआईवी रिवर्स प्रतिलेखन ब्लॉक कर सकते हैं कि यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए संशोधन के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है, हम descr जाएगाIBE inhibitors में मूल्यांकन करने के लिए परख का उपयोग कर. में सेलुलर जीनोम 19 में वायरल डीएनए सम्मिलित करता है एक आवश्यक वायरल एंजाइम है. Inhibitors में आशाजनक की एक संख्या विकसित किया जा रहा है, जिनमें से कुछ वर्तमान में, केवल Isentress 20, 21 (भी raltegravir या RAL के रूप में जाना जाता है) नैदानिक ​​परीक्षणों के दौर से गुजर रहे हैं और हाल ही में, Elvitegravir (EVG) 22 और Dolutegravir (DTG) 23 कर दिया गया है एफडीए द्वारा मंजूरी दे दी. इन यौगिकों एचआईवी बी और सेल संस्कृति में गैर बी उपप्रकार दोनों के खिलाफ और रोगियों 24, 25 में सक्रिय हैं. हालांकि, RAL साथ उपचार Y143R, N155H, और G140S/Q148H 24, 26-31 सहित म्यूटेंट, में दवा प्रतिरोधी एचआईवी -1 के लिए चुनता है. N155H और G140S/Q148H भी इन प्रतिरोध म्यूटेशनों के खिलाफ प्रभावी रहे हैं कि किनारा स्थानांतरण अवरोधक (INSTIs) में दूसरी पीढ़ी के डिजाइन और विकसित करने की जरूरत पर जोर दिया जो EVG की प्रभावकारिता, कम.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

विरोधी एचआईवी दवाओं की एक संख्या अनुमोदित किया गया है, विषाक्तता और दवा प्रतिरोध के साथ समस्या अभी भी वहाँ हैं. यह कम से कम विषाक्तता के साथ आम दवा प्रतिरोधी एचआईवी -1 उपभेदों द्वारा संक्रमण को बाधित कर सकते हैं कि नए यौगिकों की पहचान करने के लिए एक आवश्यकता को दर्शाता है. यहाँ हम तेजी से सेलुलर cytotoxicity और WT और उत्परिवर्ती वायरल उपभेदों के खिलाफ एक यौगिक की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक कुशल परख का वर्णन. वांछित लक्ष्य सेल लाइन एक 96 अच्छी तरह से थाली में वरीयता दी गई है और एक 24 घंटे ऊष्मायन के बाद, परीक्षण किया जाना यौगिकों के क्रमानुसार dilutions जोड़ रहे हैं. आगे कोई जोड़तोड़ सेलुलर cytotoxicity assays के लिए आवश्यक हैं; विरोधी के लिए एचआईवी luciferase कोशिकाओं को जोड़ा है व्यक्त करता है कि एक गुम्मट या दवा प्रतिरोधी एचआईवी -1 वेक्टर या तो की एक पूर्व निर्धारित राशि assays. Cytotoxicity एक एटीपी निर्भर luminescence परख और संक्रामकता पर यौगिकों के प्रभाव का उपयोग करके मापा जाता है lucife की राशि का निर्धारण से मापा जाता हैउपस्थिति या ख्यात inhibitors के अभाव में चुनना. इस स्क्रीनिंग परख पूरा करने के लिए 4 दिन लगते हैं और कई यौगिकों समानांतर में जांच की जा सकती है. यौगिकों तीन प्रतियों में जांच कर रहे हैं और डेटा लक्ष्य यौगिकों के अभाव में संक्रामकता / एटीपी स्तर के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं. इस तकनीक को संभावित विरोधी एचआईवी यौगिकों की प्रभावकारिता और विषाक्तता का एक त्वरित और सटीक मापन प्रदान करता है.

परख (चित्रा 1, चरण 1 और 2) सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया था, तो luciferase मूल्यों तालिका 2 में प्रस्तुत आंकड़ों सदृश चाहिए एकाग्रता रेंज भर में स्कैन करें.; एक संभावित शक्तिशाली यौगिक बाएं से दाएं luciferase गतिविधि बढ़ रही खोलेगा, और नियंत्रण उच्चतम luciferase गतिविधि नहीं होनी चाहिए. Luciferase गतिविधि एकाग्रता रेंज भर में 0.1 सापेक्ष luciferase इकाइयों (RLUs) से अधिक नहीं है, यह आमतौर पर मिश्रित कोशिकाओं को मार डाला है कि इंगित करता है. Luciferase डेटा से अधिक है या सब धारावाहिक dilutions भर में 2.0 RLUs के बराबर है, तो यौगिकों का परीक्षण सांद्रता में एचआईवी -1 संक्रमण को बाधित करने में सक्षम नहीं थे. Kaleidagraph (3 टेबल, भाग एक) में luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध बनाम यौगिकों की एकाग्रता की साजिश रचने, रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण प्रदर्शन करने के बाद, टी करने के लिए इसी तरह के परिणाम का उत्पादन होगा<html> तालिका 3, भाग बी में दिखाया नली <img alt="चित्रा 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> एचआईवी -1 वायरल स्टॉक और सेलुलर cytotoxicity और एकल दौर संक्रामकता assays के सेटअप के चित्रा 1. तैयारी. चरण 1 में, 293T कोशिकाओं pNL4.3ΔEnv.LUC और VSV जी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं और वायरस 34 निर्माण करने के लिए 48 घंटे के लिए incubated . यह संक्रामकता assays में प्रयोग किया जाता है जब तक वायरस (aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर) काटा और संग्रहीत किया जाता है. चरण 2 के लिए, अस्पताल कोशिकाओं को एक 96 अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और 24 घंटे के लिए incubated. कोशिकाओं तो 3 घंटे के लिए परीक्षण किया जाना यौगिकों के धारावाहिक dilutions के साथ preincubated और फिर वायरस (गुम्मट या दवा प्रतिरोधी या तो) से संक्रमित हैं. एक 48 घंटा ऊष्मायन के बाद, luciferase गतिविधि मापा जाता है. le1.jpg &quot;चौड़ाई =&quot; 300 &quot;/&gt; तालिका 1. धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रोटोटाइप स्क्रीनिंग ड्रग. एक और अधिक कठोर स्क्रीनिंग आम तौर पर 10 माइक्रोन से शुरू और 0.0005 माइक्रोन पर समाप्त जो 11 धारावाहिक dilutions शामिल है. धारावाहिक dilutions 10x तैयार कर रहे हैं; कोशिकाओं के 100 μl और अच्छी तरह से प्रत्येक में वायरस के 100 μl) कर रहे हैं. इस मात्रा और इन गणनाओं के बाद कम, धारावाहिक dilutions एक पूरे 96 अच्छी तरह से थाली की 3 पंक्तियों के लिए पर्याप्त होगा. cytotoxicity assays इसी तैयार कर रहे हैं; हालांकि 11 धारावाहिक dilutions 250 माइक्रोन से शुरू और 0.05 माइक्रोन पर खत्म होता है. Dilutions की केवल 11 μl कोशिकाओं के 100 μl होते हैं कि थाली में वेल्स को जोड़ रहे हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <img alt="तालिका 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; तालिका 2. Luciferase संकेत डेटा readout और luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध का निर्धारण. डेटा तालिका एक सफल परिसर के लिए luciferase डेटा की एक विशिष्ट सेट से पता चलता है. टेबल भी luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध और सीसी 50 और आईसी 50 मूल्यों को निर्धारित करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त गणना से पता चलता है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a> <img alt="तालिका 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> तालिका 3. रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण डेटा तालिका. भाग ए. Kaleidagraph में luciferase गतिविधि का प्रतिशत निषेध बनाम इस्तेमाल किया एकाग्रता सीमा रेखांकन उपयुक्त निषेध घटता उत्पादन होगा. पार्ट बी, निषेध घटता 3 पैरामीट्रिक द्वारा परिभाषित कर रहे हैंsigmoidal समारोह और रेखीय प्रतिगमन द्वारा डेटा के लिए फिट 18 का विश्लेषण करती है. इस डेटा तालिका तो 50%, जैसे आईसी 50 और सीसी 50 से वायरस एकीकरण और सेलुलर cytotoxicity को बाधित करने के लिए आवश्यक दवा सांद्रता की गणना करने के लिए माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

यहाँ हम सेलुलर cytotoxicity का वर्णन है और यौगिकों के तेजी से और सही जांच के लिए अनुमति देते हैं कि एक दौर संक्रामकता assays उनके सेलुलर cytotoxicity (सीसी 50) निर्धारित करने के लिए और गुम्मट और दवा एचआईवी -1 प्रतिरोधी के खिलाफ आईसी 50 मूल्यों.

एचआईवी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और इंटिग्रेस inhibitors की तेजी से जांच

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

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