Name: rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av egenutført Research Program av NCI.

En. Utarbeidelse av mastergrads Aksjer <ol><li> Lag stam bestander av forbindelsene som skal testes i DMSO. Forbered aksjer til en standard konsentrasjon på 20 mM. Merk: en hvilken som helst konsentrasjon over 10 mm kan anvendes. Forbindelser som kan brukes som positive kontroller for å validere denne analysen omfatter RAL, EVG, og DTG. </li><li> Sikre forbindelsene oppløses i DMSO ved å virvle oppløsningene flere ganger i 15 sekunder og inkubering ved RT i 1 time. Oppbevar 20 mM stamløsninger i mørket ved -20 ° C inntil bruk. </li></ol> 2. Utarbeidelse av 96-brønners plater for Compound Screening <ol><li> Velg cellelinjen som skal testes (for eksempel HOS eller TZM-bl), og frø i 100 ul av de celler i en tetthet på 4 x 10 4 celler / ml (4.000 celler / brønn) i mediet (f.eks Dulbeccos modifiserte Eagle &#39;s eller DMEM medium supplert med 5% (v / v) føtalt bovint serum, 5% nyfødt kalveserum og penicillin (50 enheter / ml) pluss streptomycin). </li></ol> Tre. Generering av Virus Aksjer Produsere VSV-g-pseudotyped HIV ved å transfektere 293-celler (som vist i Figur 1, trinn 1) 32-34. <ol><li> På dagen før transfeksjon, plate 293 celler i 100 mm diameter retter til en tetthet på 1,5 x 10 6 celler. </li><li> På dagen for transfeksjon, transfektere 293-celler med 16 mikrogram av villtype eller mutant HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) og 4 ug av VSV (pHCMV-g) ved hjelp av kalsiumfosfat-metoden 35.. </li><li> Omtrent 6 timer etter at kalsium-fosfat utfelling blir tilsatt, vasker 293 cellene to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) og inkuberes med friskt media i 48 timer. [DMEM supplert med 5% (v / v) føtalt bovint serum, 5% nyfødt kalveserum og penicillin (50 enheter / ml) pluss streptomycin (50 ug / ml)]. </li><li> Høste viruset inneholder Supernatantene ved å fjerne media fra diameter på 100 mmretter, klar supernatantene ved sentrifugering ved lav hastighet 3000 rpm i 10 minutter, filtrerer supernatantene gjennom en 45 mikrometer porestørrelse sprøytefilter, behandle supernatantene med Turbo DNase i 30 min ved RT og fortynnet supernatantene i mediet for tilberedning i smitte assays . Oppbevar de virale supernatants frosset, og i tilmålte porsjoner, ved -80 ° C. Merk: mengden av p24 i supernatanten bestemmes ved hjelp av en HIV-1 p24 enzym-linked immunosorbent assay kit. Det p24-konsentrasjon brukes for å kontrollere mengden av virus i prøven. Omtrent 500 ng av virus tilsettes HOS-celler sådd ut på 60 mm diameter retter med en tetthet på 1,5 x 10 5 celler / fatet på dag før infeksjon. Etter en 48 timers inkubasjon ble cellene høstet, oppsamlet ved sentrifugering, vasket og resuspendert i 100 pl PBS. Legg en lik mengde luminescens reporter gen assay reagens og måle luciferase aktivitet som beskrevet i pkt. 5.4.1 og5.4.2. Fra dette kan en passende fortynning av virus utføres som beskrevet i trinn 4.6. </li></ol> 4. Compound Screening i 96-brønners plater Screen hver forbindelse i tre eksemplarer, og gjennomsnittet av resultatene. Merk: effekten av hver forbindelse på viral replikasjon korrigeres ved å normalisere til nivået for replikasjon oppnås i fravær av en hvilken som helst forbindelse. <ol><li> Bestem empirisk konsentrasjonsområdet skal skjermes. Merk: vanligvis, er skjermene med 11 seriefortynninger gjøres ved å tilsette forbindelsen til platen kolonne for kolonne, og skjermer med 7 seriefortynninger gjøres ved å tilsette forbindelsen av raden. En tre eksemplarer satt av brønner må reserveres for no sammensatte kontroll. I tillegg må en kolonne eller en rad være tom for å fungere som en negativ / bakgrunnskontroll. Endelig, uansett om det er en cellulær cytotoksisitet eller infektivitet assay vil diktere hvis viruset ble tilsatt. </li><li> Forberedseriefortynninger fra 20 mM stamløsning. Konsentrasjonene velges avhengig av den empirisk bestemt konsentrasjonsområde som skal testes (som vist i tabell 1). Forbered fortynninger i media på 10x den endelige konsentrasjonen ønsket, dvs. hvis den endelige konsentrasjonen skal være 100 mikrometer, lage en 1 mm arbeids lager. Merk: forbindelser med IC 50 s over 5-10 mikrometer er vanligvis ikke gode kandidater for legemiddelutvikling. I de innledende analysene tester vi forbindelsene bare mot WT vektor. Lovende forbindelser som effektivt inhiberer WT vektoren blir så testet mot et panel av medikament-resistente mutanter. </li><li> Fjern 96-brønners plater fra inkubatoren og tilsett de serielle fortynninger av forbindelsene som skal testes til brønnene in triplo (som vist i Figur 1, trinn 2). Merk: volumet tilsatt til brønnen bør være 1/10 av volumet av den endelig konsentrasjon. Således, tilsett 22 ul / brønn (sluttvolum pOST virus tillegg er 220 mL) for smittsomhet analyser. For cytotoksisitetstester analyser, legge 11 mL / brønn (endelig volum er 110 mL / brønn). </li><li> Returner 96-brønners plater til inkubatoren. For en cellulær cytotoksisitet skjerm, ruge 96-brønners plater 48 timer ved 37 ° C og ingen ytterligere manipulasjoner er nødvendig i protokoll 4: fortsett til protokoll 5 For smittsomhet analyser, fortsette å følge instruksjonene i protokoll 4.. </li><li> Smittsomhet analyser bare. Fjerne platene fra inkubatoren etter minst 3 timers inkubering ved 37 ° C med forbindelsen som skal analyseres. Merk: Dette gjør det mulig for forbindelsen å bli tatt opp av cellene før infeksjon med HIV-vektor. </li><li> Forbered et lager fortynning av viruset 33, 34 (vanligvis ca 1:03) som vil produsere en luciferase signal mellom 0,2 til 1,5 relative luciferase enheter (RLU) i ubehandlede celler. En hel plate vil ta cirka 10 ml fortynningted virus. Tilsett 100 ul av virus til hver av brønnene, enten ved hjelp av en 8 eller 12 multikanalpipette. Ikke legg virus til kontrollbrønner negativ / bakgrunn. Retur platene til en 37 ° C inkubator i 48 timer. Merk: en 01:03 lager fortynning av virus er typisk fortynning som vil produsere en luciferase-signal mellom 0,2 -1,5 RLU basert på et p24-analyse som viser at viruskonsentrasjonen i supernatanten er omtrent 500 ng i 1,0 ml. </li></ol> 5. Forberedelse og måling av cytotoksisitet og smitte i 96-brønners plater <ol><li> Aspirer media fra brønnene (fenol rød i media kan forstyrre luciferase signal). Bruk et glass pipette med en 200 mL pipette tips festet til enden. Begynn på toppen av media og sakte jobbe seg ned mot nedre hjørne av brønnen. Ikke bruker for mye tid på bunnen av brønnen, eller cellene kan fjernes fra brønnen. </li><li> Tilsett 100 ul PBS supplert med 0,5 mM MgCl 2 til hver brønn. Dette må gjøres umiddelbart etter at media er fjernet, slik at cellene ikke tørker ut. </li><li> Bare for cytotoksisitet analyser, legge 5 ml substrat buffer fra luminescens ATP deteksjon analysen til hvert hetteglass med medfølgende lyofilisert reagens. En ampulle som er tilstrekkelig for en 96-brønns plate. <ol><li> Tilsett 50 pl av cellelyseringsbuffer fra ATP Luminescence deteksjons assay til hver brønn. Rist 96-brønns plate ved 700 rpm ved RT i 5 min ved bruk av en kompakt Thermo. </li><li> Tilsett 50 mL av rekonstituert luminescens ATP deteksjon assay reagens til alle brønnene med unntak for de negative kontroll / bakgrunnsbrønner. Rist ved 700 rpm ved romtemperatur i 5 min ved bruk av en kompakt Thermo. Inkuber platene ved romtemperatur i 20 min for å gi tid for signalutvikling. </li><li> Les 96-brønns plate ved hjelp av mikro luminometer. Merk: åpne SoftMax Pro mikro luminometer program. Sørg luminometeret er satt til å måle lumiscence ved en sensitivitet på 5 avlesninger / brønn. </li></ol></li><li> Bare for smittsomhet assays, tilsett 10 ml av substrat-buffer fra Luminescence reporter gene assay til hver ampulle av lyofilisert reagens leveres. En ampulle som er tilstrekkelig for hver 96-brønns plate. <ol><li> Tilsett 100 ul av rekonstituert Luminescence reporter gene assay-reagens til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i 20 min for å gi tid for signalutvikling. </li><li> Les 96-brønns plate ved hjelp av en mikro luminometer som utføres i avsnitt 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Fastsettelse av CC 50 og IC 50 Verdier for forbindelser <ol><li> Overfør luciferase data fra mikro luminometer inn et Excel-regneark. <ol><li> Gjennomsnittlig både luciferase data i tre eksemplarer og bakgrunn / styredata. Subtrahere den gjennomsnittlige bakgrunn / styresignal fra den gjennomsnittlige triplikat signal for hele konsentrasjonsområdet. </li> &lt;li&gt; Normal bakgrunnen korrigert gjennomsnittlig signal for de konsentrasjonsområder mot aktivitet, hvorvidt det er cytotoksisitet eller smittsomhet, i fravær av en hvilken som helst forbindelse for å bestemme den prosentvise inhibering. Merk: prosent inhibering er definert som luciferase aktiviteten i nærvær av legemiddel, delt på luciferase-aktivitet i fravær av medikamentet, multiplisert med 100.. </li></ol></li><li> Bruk Kaleidagraph program for å skaffe CC 50 og IC 50 verdier <ol><li> Overfør både empirisk bestemt konsentrasjonsområde og prosent hemming av luciferase aktivitet inn Kaleidagraph. </li><li> Plotte dataene med konsentrasjonsområdet på x-aksen og prosent inhibering av luciferase-aktivitet på y-aksen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Vi beskriver en rask, effektiv og reproduserbar assay som kan brukes til å screene forbindelser for cytotoksisitet og for deres evne til å hemme replikasjonen av både WT og legemiddelresistente HIV-1. Evnen til raskt å identifisere forbindelser og teste sin effekt og cytotoksisitet er avgjørende i utviklingen av nye og bedre medisiner mot HIV-1. Når blyforbindelser er identifisert, kan analoger av ledningen forbindelsen fremstilles og testes ved hjelp av den samme assay. Analysen er relativt enkel. Det finnes både positive og negative kontroller som tillater brukeren å diagnostisere de vanligste problemene (giftige forbindelser, problemer med vektoren lager). Bruken av et triplikat sett av brønner uten tilsatt forbindelse viser at viral infeksjon har funnet sted. Det faktum at cytotoksisiteten er målt i en uavhengig analyse misinterpreting unngår en reduksjon av luciferase som skyldes cytotoksisitet som en spesifikk effekt på viral replikasjon. De kritiske trinnenei protokollen blir fremstilling av platene, slik at cellene er jevnt fordelt i brønnene, for at brønnene har de riktige konsentrasjoner av forbindelsene som skal testes, og legger til den samme mengden av virus til hver av brønnene, og å måle luciferase-aktivitet for å bestemme CC 50 og IC 50 verdier. Analysen er trygt, kvantitativ og reproduserbar. Analysen er trygg fordi vektoren er replikering defekt. Analysen er kvantitativ og reproduserbar, fordi den er basert på en enkelt runde vektor som uttrykker luciferase, som kan undersøkes nøyaktig og bekvemt. I en fler runde virusreplikasjon assay, den målte IC 50 avhenger av antallet av virale livssyklus; Dette er et særlig problem når analysene involverer både WT og medikament-resistente virus som kan ha betydelig forskjellige replikasjonskapasiteter. Det har vært flere enzymatiske analyser rapportert tidligere at kanbrukes til å screene for IN-hemmere. Analyser som involverer sanntid PCR-teknologi for å måle integrerte DNA krever rensede rekombinante proteiner (e), og er generelt, både mer arbeidskrevende og kostbart 36, 37. Selv om det er mulig å anvende enzymatiske analyser for å måle effekten av forbindelsene på de andre virale enzymer (RT og protease), hvert enzym krever sin egen bestemmelsessystem. Den runde vektor assay, som beskrevet, kan brukes, uten modifikasjon, for å screene for RT-inhibitorer. En lignende analyse kan bli brukt til å screene for protease-inhibitorer; Imidlertid, i en protease inhibitor analysen kan forbindelsene må tilsettes til cellene brukes i fremstillingen av vektorer. En beslektet assay, ved hjelp av forskjellige celler og vektorer, kan også brukes til å screene for konvolutten (env) og HIV-entry-inhibitorer fusjon. Til slutt, kan analysen bli brukt, i større målestokk, med automatiserte robot dispensere. Således kan analysen benyttes for å screene store biblioteker av forbindelser mot WT og mutant HIV. Imidlertid er det faktum at analysen kan detektere en inhibitor for HIV-replikasjon som virker på forskjellige stadier av den virale livssyklus i retning av en begrensning i å tolke dataene. Ved selve analysen ikke definerer hvilke trinn i livssyklusen er blokkert av en forbindelse. Dersom det oppstår dette spørsmålet, kan den løses ved hjelp av tidspunktet for addisjon assays 38, og ved å teste forbindelsen mot rensede rekombinante virale proteiner. Dessverre finnes det, til tross for suksessen med anti HIV-legemidler, er det fortsatt problemer med både motstand og toksisitet. I fravær av et effektivt anti HIV-vaksine, er det behov for ikke bare å utvikle nye terapeutiske midler som vil være effektiv mot det eksisterende medikament-resistente mutanter, men også for å utvikle profylaktiske medikamenter som kan redusere spredningen av viruset. Hvis profylaktisk bruk av anti HIV medisiner incudes behandling av friske mennesker, vil denne tilnærmingen plassere en spesiell belastning for å utvikle medikamenter som har little eller ingen langsiktig giftighet.

Tilgjengeligheten av legemidler rettet mot flere viktige skritt i den HIV-1 viral livssyklus har ført til kombinasjonen medikamentell behandling (kalt høyaktiv antiretroviral terapi, eller HAART) som har kraftig forbedret behandling av HIV-1-infeksjoner, og den langsiktige overlevelsen av pasientene. HAART, som typisk bruker kombinasjoner av to nukleosid revers transkriptase (RT) hemmere og enten en proteasehemmer eller en ikke nukleosid RT inhibitor, har nå konvertert en dødelig sykdom til en livslang tilstand 1-5. Men til tross for de mange suksesser av HAART i vedvarende undertrykkelse av virusreplikasjon, har det begrensninger. HAART ikke utrydde hiv, slik at pasientene ikke er kurert og behandlingen er livslang. Det er problemer med narkotika toksisitet og med fremveksten av resistente stammer. Motstand kan oppstå til alle de godkjente anti HIV medisiner, inkludert de nylig godkjente legemidler som mål HIV integrase (IN). Legemiddelresistens sannsynlig oppstår becabruk av spontane mutasjoner som oppstår under virusreplikasjon (feilrate på 3 x 10 -5 mutasjoner / base / replikering syklus) 6. Når mutasjoner oppstår i genene som koder for målene for antiretrovirale medikamenter, vil en liten undergruppe av disse mutasjonene fører til en reduksjon i følsomhet av viral belastning til medikamentene. For å unngå utvikling av resistens, må legemiddelkonsentrasjoner opprettholdes på et nivå som fullstendig undertrykke HIV-replikasjon. Dårlig tilslutning til den terapeutiske behandlingen forverrer problemet, og kan føre til rask utvikling av resistens 7-9. Selv om medikamentkonsentrasjonen kan variere i pasienter på grunn av forskjellig absorpsjon, metabolisme, fordeling og utskillelse, kan høye konsentrasjoner av narkotika føre til toksisitet 10.. Siden behandlingen fortsetter for livet av pasienten, er det alvorlige sikkerhetsmessige bekymringer om den langsiktige toksisitet av anti retrovirals. Den anti retrovirals som vanligvis brukes i HAART kan ha negative effekter ennd det har vært tilfeller der bivirkningene har blitt livstruende 11-15. Problemene pasientene møter med utvikling av resistens og toksisitet har skapt behovet for å utvikle nye medikamenter som effektivt blokkerer replikering av de vanligste legemiddelresistente stammer av viruset med liten eller ingen langsiktig giftighet. Det er således et behov for en metode som kan screene for forbindelser som blokkerer viktige trinn i viral livssyklus raskt. Her beskriver vi en effektiv assay som kan brukes til å evaluere cytotoksisiteten av forbindelser og deres evne til å blokkere replikasjon av både WT og medikamentresistente HIV-stammer raskt og effektivt. Analysen vi bruker er lik en assay som ble utviklet for å screene for legemiddelresistens i virus isolert fra pasienter 16-18. Selv om analysen kan brukes uten modifikasjon for screening av forbindelser som kan blokkere HIV revers transkripsjon, vil vi Hei Kjære venneribe ved hjelp av analysen til å evaluere inhibitorer. IN er et essensielt viralt enzym som setter det virale DNA i cellegenomet 19.. Selv om en rekke lovende hemmere er under utvikling, er noen som for tiden gjennomgår kliniske studier, bare ISENTRESS 20, 21 (også kjent som Raltegravir eller RAL) og mer nylig, Elvitegravir (EVG) 22 og Dolutegravir (DTG) 23 har vært godkjent av FDA. Disse forbindelser er aktive mot både HIV-og ikke-B B subtyper i cellekultur, og hos pasienter 24, 25. Men velger behandling med RAL for multiresistent HIV-1 IN mutanter, inkludert Y143R, N155H, og G140S/Q148H 24, 26-31. N155H og G140S/Q148H også redusert effekt av EVG, noe som understreker behovet for å designe og utvikle andre generasjon i Strand overføre hemmere (INSTIs) som er effektive mot disse resistente mutasjoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Selv om en rekke anti HIV-legemidler har blitt godkjent, er det fortsatt problemer med toksisitet og resistens. Dette viser et behov for å identifisere nye forbindelser som kan hemme infeksjon av de vanlige legemiddelresistent HIV-1-stammer med minimal toksisitet. Her beskriver vi en effektiv assay som kan brukes til raskt å bestemme cellulær cytotoksisitet og effekten av en forbindelse mot WT og mutante virusstammer. Det ønskede mål-cellelinje er sådd i en 96-brønners plate, og etter en 24 timers inkubasjon i serie fortynninger av forbindelsene som skal testes legges. Ingen ytterligere manipulasjoner som er nødvendige for cellulær cytotoksisitet assays; for anti HIV-analysene en på forhånd bestemt mengde av enten en WT-eller legemiddelresistente HIV-1-vektor som uttrykker luciferase tilsettes til cellene. Cytotoksisitet er målt ved hjelp av en ATP-avhengig luminescens analyse og virkningen av forbindelsene på infektivitet er målt ved å bestemme mengden av luciferase i nærvær eller fravær av de antatte inhibitorer. Dette screening analysen tar fire dager å fullføre, og flere forbindelser kan bli vist i parallell. Forbindelser som er vist i triplikat, og dataene er normalisert til infectivity / ATP-nivåer i fravær av målforbindelser. Denne teknikken gir en rask og nøyaktig måling av effekt og toksisitet av potensielle anti-HIV-forbindelser.

Hvis analysen (Figur 1, trinn 1 og 2) ble vellykket utført, så luciferase-verdier bør ligne de data som presenteres i tabell 2 Scan over konsentrasjonsområdet.; en potensielt potent forbindelsen vil avsløre økende luciferase-aktivitet fra venstre mot høyre, og styringen bør ha den høyest luciferase-aktivitet. Dersom luciferase-aktivitet ikke overstiger 0,1 Relative luciferase enheter (RLU) på tvers av konsentrasjonsområdet, vanligvis indikerer dette at forbindelsen drepte cellene. Dersom luciferase data er større enn eller lik 2,0 RLU på de serielle fortynninger, så kan forbindelsene var ikke i stand til å hemme HIV-1-infeksjoner ved de testede konsentrasjoner. Plotting av konsentrasjonen av forbindelsene sammenlignet med den prosentvise inhibering av luciferase-aktivitet i Kaleidagraph (Tabell 3, del A), etter å ha utført lineær regresjonsanalyse, vil gi resultater som ligner t<html> slange er vist i tabell 3, del B. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Utarbeidelse av HIV-1 Viral Aksjer og oppsett av cellulær cytotoksisitet og Single-runde Smittsomhet Analyser. I trinn 1, er 293T celler transfektert med pNL4.3ΔEnv.LUC og VSV-G og ruges i 48 timer å produsere virus 34 . Viruset blir høstet og lagret (frosset ved -80 ° C i alikvoter) inntil den blir brukt i smittsomhet assays. For trinn 2, blir HOS-celler utsådd i en 96-brønns plate og inkubert i 24 timer. Cellene blir deretter preinkuberes med serielle fortynninger av forbindelsene som skal testes i 3 timer og deretter infisert med virus (enten WT eller resistent). Etter en 48 timers inkubasjon blir luciferase-aktivitet målt. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabell 1. Drug Screening seriell fortynning Prototype. Et strengere screening innebærer 11 seriefortynning som vanligvis starter på 10 mm og ender på 0.0005 mikrometer. De serielle fortynninger er forberedt 10x; er det 100 ul celler og 100 ul av virus i hver brønn). På dette volum og følge disse beregninger vil de serielle fortynninger være nok for tre rekker med en hel 96-brønns plate. Cytotoksisitet analysene er forberedt på samme måte; men de 11 seriefortynning starter på 250 mikrometer og ende på 0,05 mikrometer. Kun 11 mL av de fortynninger legges til brønnene i plate som inneholder 100 mL av celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Tabell 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabell 2. Luciferase Signaldataavlesning og Bestemmelse av prosentvis Hemming av Luciferase aktivitet. Datatabellen viser et vanlig sett med luciferase data for en vellykket sammensatt. Tabellen viser også de tilleggsberegninger for å bestemme prosent hemming av luciferase aktivitet og CC 50 og IC 50 verdier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Tabell 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabell 3. Lineær regresjonsanalyse datatabell. Del A. Grafisk fremstilling av konsentrasjonsområdet som brukes i forhold til den prosentvise inhibering av luciferase-aktivitet i Kaleidagraph vil produsere de passende inhiberingskurver. Del B: De inhiberingskurver er definert av tre parasigmoidal funksjon og tilpasning til dataene ved lineære regresjonsanalyser 18.. Dette datatabellen er så brukt i forbindelse med Microsoft Excel for å beregne konsentrasjon av legemidlet som kreves for å hemme virus integrering og cellulær cytotoksisitet av 50%, f.eks IC 50 og CC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Her beskriver vi cellulær cytotoksisitet og enkelt runde smittsomhet analyser som gjør det mulig raskt og nøyaktig screening av forbindelser for å bestemme deres cellulære cytotoksisitet (CC 50) og IC-50 verdier mot WT og legemiddelresistente HIV-1.

Rapid Screening av HIV revers transkriptase og integrasehemmere

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Reverse genetikk Mediated Gjenvinning av Infeksiøs murin Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Høy gjennomstrømming Screening for Bredspektret Chemical hemmere av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid annealing-mediert elektroforese (NAVN) analysen Lar Rapid Identifikasjon av HIV-1 nucleocapsid hemmere

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Effekt og Cytotoksisitet Screening av inhibitorer målretting Intracellulær<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Matbårne patogen Screening bruker Magneto-fluorescerende Nanosensor: Rask påvisning av E. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Oppdagelse og fjerning av Nuclease forurensning under rensing av rekombinant Prototype skummende Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...