Name: rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Это исследование было поддержано исследовательской программы Интрамурального от NCI.

1. Подготовка магистерских Акции <ol><li> Сделать мастер запасы соединений, которые будут протестированы в ДМСО. Подготовка материала по стандартной концентрации 20 мМ. Примечание: любая концентрация выше 10 мМ могут быть использованы. Соединения, которые могут быть использованы в качестве положительного контроля для проверки этого теста включают RAL, EVG и DTG. </li><li> Обеспечить соединения растворяют в ДМСО при интенсивном перемешивании решений несколько раз в течение 15 секунд и инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа. Храните 20 мм растворы в темноте при температуре -20 ° С до использования. </li></ol> 2. Подготовка 96-луночных для соединения скрининга <ol><li> Выберите клеточной линии, подлежащий испытанию (например HOS или ТЗМ-BL), и семян 100 мкл этих клеток при плотности 4 х 10 4 клеток / мл (4000 клеток / лунку) в средствах массовой информации (например, изменение орла или DMEM среда Дульбекко с добавлением 5% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки, 5% новорожденных телячьей сывороткой, пенициллином и (50 ед / мл) плюс Streptomycin). </li></ol> 3. Генерация запасов вируса Производить VSV-G-pseudotyped ВИЧ путем трансфекции клеток 293 (как показано на рисунке 1, стадия 1) 32-34. <ol><li> В день до трансфекции пластины 293 клеток на 100 блюд диаметра мм при плотности 1,5 × 10 6 клеток. </li><li> В день трансфекции трансфекции клеток 293 с 16 мкг дикого типа или мутантного ВИЧ (pNLNgoMIVR - ΔLUC) и 4 мкг (VSV-pHCMV г) с использованием метода фосфата кальция 35. </li><li> Приблизительно 6 ч после осадка фосфата кальция добавляется, мыть 293 клеток дважды забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и инкубируют в свежей средой в течение 48 часов. [DMEM с добавлением 5% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки, 5% новорожденных телячьей сыворотки, и пенициллин (50 единиц / мл) плюс стрептомицин (50 мкг / мл)]. </li><li> Урожай вирус, содержащий супернатантами по извлечением носителя из диаметра 100 ммблюда, уточнить супернатантов от низкоскоростного центрифугирования при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин, отфильтровать супернатантами через 45 размер пор мкм шприцевой фильтр, лечить супернатантов с Turbo ДНКазы в течение 30 мин при комнатной температуре и разбавляют супернатанты в СМИ для подготовки в инфекционных анализах . Храните вирусные супернатанты замороженные, в аликвотах, при температуре -80 ° С. Примечание: количество p24 в супернатанте определяется с помощью p24 иммуноферментного набора для анализа на ВИЧ-1. Концентрацию p24 используется для контроля количества вируса в образце. Примерно 500 нг вируса добавляется в HOS посеянных клеток на чашках диаметром 60 мм при плотности 1,5 х 10 5 клеток / блюдо в день до инфекции. После 48 ч инкубации клетки собирали, собирали центрифугированием, промывали и ресуспендировали в 100 мкл PBS. Добавить равное количество люминесценции репортера гена анализа реагента и измеряют активность люциферазы, как описано в разделах 5.4.1 и5.4.2. Исходя из этого, целесообразно разведение вируса может быть сделано, как описано в шаге 4.6. </li></ol> 4. Соединение скрининг в 96-луночных Экран каждого соединения в трех экземплярах и усреднить результаты. Примечание: эффект каждого соединения по репликации вируса корректируется путем нормализации до уровня репликации, полученной в отсутствие какого-либо соединения. <ol><li> Определите эмпирическую диапазон концентраций быть экранированный. Примечание: Как правило, экраны с 11 серийных разведений изготовлены путем добавлени соединени в тарельчатой ​​колонне по колонне и экранов с 7 серийных разведений изготовлены путем добавлени соединени по ряду. Один набор скважин трех экземплярах должны быть зарезервированы для контроля нет соединения. Кроме того, один столбец или одну строку должен оставаться пустым, чтобы выступать в качестве отрицательного / фонового контроля. Наконец, является ли он или клеточную цитотоксичность анализ инфекционности будет диктовать если вирус добавляется. </li><li> Готовитьсерийные разведения от 20 мМ маточного раствора. Концентрации выбирают в зависимости от эмпирически определенной области концентраций, подлежащего испытанию (как показано в Таблице 1). Подготовьте разведения в СМИ в 10 раз конечная концентрация желании, то есть, если конечная концентрация будет 100 мкм, сделать рабочую акции 1 мм. Примечание: соединения с IC 50 с выше 5-10 мкм обычно не хорошими кандидатами для разработки лекарств. На начальных анализов мы испытаний соединений только против вектора мас. Перспективные соединения, которые эффективно подавляют вектор WT затем испытывают против панели лекарственной устойчивостью мутантов. </li><li> Удалить 96-луночных с из инкубатора и добавить серийные разведения соединений, которые будут протестированы в лунки в трех экземплярах (как показано на рисунке 1, стадия 2). Примечание: объем добавлен в скважине должна быть 1/10 объем конечной концентрации. Таким образом, добавить 22 мкл / лунку (конечный объем рВирус ост добавление 220 мкл) для инфекционности анализов. Для цитотоксичность, добавить 11 мкл / лунку (конечный объем 110 мкл / лунку). </li><li> Вернуться 96-луночных с в инкубатор. Для экрана клеточной цитотоксичности, инкубировать 96-луночных планшетах 48 ч при 37 ° С и дальнейшие манипуляции не нужны в Протоколе 4: перейти к протоколу 5 Для инфекционности анализов, по-прежнему следуя инструкциям в Протоколе 4.. </li><li> Инфекционность анализы только. Удаление пластины из инкубатора после как минимум 3 ч инкубации при 37 ° С с соединениями для анализа. Примечание: это позволяет соединение будет рассмотрен клеток до инфицирования ВИЧ вектора. </li><li> Подготовка исходного разведения вируса 33, 34 (как правило, примерно 1:3), который будет производить сигнал люциферазы между 0,2-1,5 относительных люциферазных единиц (RLUS) в необработанных клетках. Вся пластинка займет около 10 мл DiluВирус Тед. Добавьте 100 мкл вируса в каждой из лунок, с использованием либо 8 или 12 многоканальной пипетки. Не добавляйте вирус контрольных лунках негатив / фона. Возврат пластины с 37 ° C инкубаторе в течение 48 часов. Примечание: запас разбавление 1:03 вируса характерно разбавление что будет производить люциферазы сигнал между 0,2 -1,5 RLUS на основе p24 анализа, показывающие, что вирусный концентрация в надосадочной жидкости составляет примерно 500 нг в 1,0 мл. </li></ol> 5. Приготовление и оценка цитотоксичности и инфекционность в 96-луночных <ol><li> Аспирируйте носители из скважин (фенол красный в средствах массовой информации может влиять на сигнал люциферазы). Используйте стеклянную пипетку с кончика пипетки 200 мкл, закрепленный на конце. Начало в верхней СМИ и медленно работать вниз к нижнем углу хорошо. Не тратьте слишком много времени на дне колодца, или клетки могут быть удалены из колодца. </li><li> Добавить 100 мкл PBS с добавлением 0,5 мМ MgCl 2 в каждую лунку. Это должно быть сделано сразу же после среду удаляют, так что клетки не высыхают. </li><li> Только для цитотоксичность, добавить 5 мл субстратного буфера от реакции на обнаружение люминесценции АТФ в каждый флакон поставляемой лиофилизированного реагента. Один флакон достаточно для 96-луночный планшет с. <ol><li> Добавить 50 мкл буфера для лизиса клеток от реакции на обнаружение люминесценции АТФ в каждую лунку. Встряхнуть 96-луночного планшета при 700 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин с использованием компактного Thermomixer. </li><li> Добавить 50 мкл восстановленного люминесценции АТФ анализа обнаружения реагента во все лунки для отрицательного контроля / фоновых скважин, кроме. Взболтать при 700 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин с использованием компактного Thermomixer. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы дать время для развития сигнала. </li><li> Читайте пластину 96-а, используя микропланшетного люминометра. Примечание: открыть программу SOFTmax Pro микропланшет люминометра. Убедитесь, что люминометра установлен для измерения Lumiлюминесценции при чувствительности 5 показаний / лунку. </li></ol></li><li> Только для анализы в отношении инфекционности, добавляют 10 мл субстратного буфера от гена-репортера анализа люминесценции в каждый флакон подаваемого лиофилизированного реагента. Один флакон достаточно для каждого 96-луночного планшета. <ol><li> Добавить 100 мкл восстановленного люминесценции репортера гена анализа реагента в каждую лунку. Выдержите при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы дать время для развития сигнала. </li><li> Прочитать 96-луночного планшета с использованием микропланшет-люминометра, как выполняется в разделе 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Определение КС 50 и IC 50 для соединений <ol><li> Перенесите люциферазы данные из микропланшетов люминометра в таблицу Excel. <ol><li> Средний и люциферазы данные в трех экземплярах и данных сигнала фон / управления. Вычтите средний фон / управляющий сигнал от среднего сигнала трех экземплярах на всем диапазоне концентраций. </li> &lt;Li&gt; нормализовать фон исправлены среднего сигнала для диапазонах концентраций против активности, будь то цитотоксичность или инфекционность, в отсутствие любого соединения, чтобы определить процент ингибировани. Примечание: Процент ингибирования определяется как активность люциферазы в присутствии препарата, разделенной на активность люциферазы в отсутствие лекарственного средства, умноженное на 100. </li></ol></li><li> Используйте программу Kaleidagraph получить CC 50 и IC 50 значения <ol><li> Передача, как эмпирически определенный диапазон концентраций и процент ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph. </li><li> Участок данные с диапазоне концентраций по оси х и процент ингибирования активности люциферазы на оси у. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Опишем быстрый, эффективный и воспроизводимый анализ, который может быть использован для скрининга соединений на цитотоксичность и для их способности ингибировать репликацию как WT и прочной ВИЧ-1 препарата. Способность быстро идентификации соединений и проверить их эффективность и цитотоксичность имеет решающее значение в развитии новых и улучшенных препаратов против ВИЧ-1. После соединения свинца идентифицированы, аналоги соединения свинца могут быть изготовлены и испытаны с использованием того же анализа. Анализ является относительно простым. Есть как положительные, так и отрицательные элементы управления, которые позволяют пользователю диагностировать наиболее распространенные проблемы (токсических соединений, проблемы с вектором складе). Использование трех экземплярах множества скважин без добавления соединения показывает, что вирусная инфекция произошла. Тот факт, что цитотоксичность измеряется в качестве независимого анализа избегает неправильной интерпретации снижение люциферазы, вызванного цитотоксичности в качестве специфического эффекта на вирусную репликацию. Критические шагив протоколе готовят пластины таким образом, что клетки равномерно распределены в лунках, что скважины иметь соответствующие концентраций тестируемых соединений, добавляя такое же количество вируса в каждой из лунок, и измерения активности люциферазы в определить CC 50 и IC 50 значения. Анализ является безопасным, количественный, и воспроизводимым. Анализ безопасно, потому что вектор является репликация неисправен. Анализ количественный и воспроизводимым, поскольку она основана на одном круглого вектора, который экспрессирует люциферазы, который может быть оценена точно и удобно. В нескольких круглого анализа в репликации вируса, измеренная ИК 50 зависит от количества вирусных жизненных циклов; это особая проблема, когда анализы включают в себя как WT и лекарственной устойчивостью вирусов, которые могут иметь значительно различные возможности репликации. Там было несколько ферментативные анализы сообщалось ранее, что можетбыть использованы для выявления ингибиторов в. Анализы, которые включают в реальном времени технологию PCR для измерения интегрированную ДНК требуют очищенные рекомбинантные белки (ы), и, в общем, и более трудоемким и дорогим 36, 37. Хотя можно использовать ферментативные анализы для измерения воздействия соединений на других вирусных ферментов (RT и протеазы), каждый фермент требует свою собственную систему анализа. Один круглый вектор анализ, как описано, может быть использован, без изменений, для скрининга ингибиторов обратной транскриптазы. Аналогичный анализ может быть использован для скрининга ингибиторов протеазы; Однако в ингибитора протеазы анализе соединения должны быть добавлены к клеткам, используемых для получения векторов. Связанных анализ, используя различные клетки и векторы, также могут быть использованы для выявления конверте (ENV) и ингибиторов запись слияния ВИЧ. Наконец, анализ может быть использован, в увеличенном масштабе, с роботизированные распылителей. Таким образом, анализ может быть использован для скрининга больших библиотек соединений против дикого типа и мutant ВИЧ. Однако тот факт, анализ может обнаружить ингибитор репликации ВИЧ, который действует на разных стадиях вирусных точек жизненного цикла до ограничения в интерпретации данных. Сам по себе анализ не определяет, какой этап в жизненном цикле заблокирован соединения. Если возникает вопрос, она может быть решена с помощью время добавления анализов 38, и путем проверки соединение от очищенных рекомбинантных вирусных белков. К сожалению, несмотря на успех анти лекарств против ВИЧ, есть еще проблемы и с сопротивлением и токсичности. В отсутствие эффективного противотанкового вакцины против ВИЧ, существует необходимость не только для разработки новых терапевтических препаратов, которые будут эффективны против существующих устойчивых мутантов наркотиков, но и для развития профилактических препаратов, которые могут уменьшить распространение вируса. Если профилактическое применение анти лекарств против ВИЧ incudes лечение неинфицированных людей, этот подход будет уделять особое бремя на разработке препаратов, которые имеют лIttle или нет долгосрочный токсичность.

Наличие препаратов, ориентированных на несколько важных шагов в ВИЧ-1 жизненного цикла вируса привело к комбинированной лекарственной терапии (так называемый высокую активность антиретровирусная терапия, или ВААРТ), что позволило значительно улучшить лечение ВИЧ-1 инфекции, а также долгосрочное выживание пациентов. ВААРТ, которая обычно использует комбинации двух нуклеозидов обратной транскриптазы (RT) ингибиторов и либо ингибитор протеазы или не ингибитора РТ нуклеозид, в настоящее время преобразован смертельную болезнь, в длинной жизни состоянии 1-5. Однако, несмотря на многочисленные успехи ВААРТ в устойчивой подавления вирусной репликации, он имеет свои ограничения. ВААРТ не искореняет ВИЧ, поэтому пациенты не излечиваются и терапия длительный срок. Есть проблемы с наркотиками токсичности и с появлением штаммов устойчивы наркотиков. Сопротивление может возникнуть для всех утвержденных анти лекарств против ВИЧ, в том числе новых утвержденных препаратов, предназначенных ВИЧ интегразы (ПО). Лекарственная устойчивость всего возникает BECAиспользование спонтанных мутаций, которые происходят во вирусной репликации (скорость погрешность 3 х 10 цикла -5 мутации / база / репликации) 6. Когда мутации возникают в генах, кодирующих мишеней анти ретровирусов, небольшая часть этих мутаций приведет к снижению восприимчивости вирусного штамма к препаратам. Чтобы избежать развития лекарственной устойчивости, концентрации препарата должна поддерживаться на уровне, который полностью подавляют репликацию ВИЧ. Несоблюдение лечебного режима усугубляет проблему, и может привести к быстрому развитию резистентности 7-9. Хотя концентрации препарата может варьироваться у пациентов из-за отличающейся поглощения, обмена веществ, распределения и уровней экскреции, высокие концентрации препарата может привести к токсичности 10. Поскольку терапия продолжается в течение жизни пациента, существуют серьезные проблемы безопасности о долгосрочной токсичности анти retrovirals. Анти retrovirals, обычно используемые в ВААРТ может иметь неблагоприятные последствияй были случаи, когда побочные эффекты были опасными для жизни 11-15. Проблемы пациентов сталкиваются с развитием резистентности и токсичности объясняют необходимость разработки новых лекарств, которые эффективно блокируют репликацию общих лекарствам штаммов вируса практически без долгосрочного токсичности. Таким образом, существует потребность в анализе, который может скрининга соединений, которые блокируют основные этапы в жизненном цикле вируса быстро. Здесь мы описываем эффективного анализа, который может использоваться для оценки цитотоксичности в соединений и их способностью блокировать репликацию как дикого типа и штаммов ВИЧ с лекарственной устойчивостью быстро и эффективно. Анализ мы используем похож на анализе, который был разработан для выявления лекарственной устойчивости вируса, выделенного у больных 16-18. Хотя анализ может быть использован без модификации для скрининга соединений, которые могут блокировать обратную транскрипцию ВИЧ, мы будем DescrМБП с использованием анализа для оценки В ингибиторы. В является важным вирусный фермент, который вставляет вирусной ДНК в клеточный геном 19. Хотя ряд перспективных в ингибиторов в настоящее время разрабатываются, некоторые из которых в настоящее время проходят клинические испытания, только Isentress 20, 21 (также известный как Ралтегравир или RAL) и совсем недавно, элвитегравира (ГО) 22 и Dolutegravir (DTG) 23 закончились утвержден FDA. Эти соединения являются активными и против ВИЧ B и не являющихся B подтипов в клеточной культуре и больных 24, 25. Однако лечение RAL выбирает для лекарственно-устойчивого ВИЧ-1 у мутантов, в том числе Y143R, N155H и G140S/Q148H 24 26-31. N155H и G140S/Q148H также снизить эффективность EVG, и это подчеркивает необходимость проектирования и разработки второго поколения в ингибиторов переноса цепи (INSTIs), которые являются эффективными против этих мутаций резистентности.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Хотя ряд анти лекарств против ВИЧ были одобрены, все еще существуют проблемы с токсичностью и лекарственной устойчивости. Это показывает необходимость идентификации новых соединений, которые могут ингибировать инфекцию общими лекарственной устойчивостью штаммов ВИЧ-1 с минимальной токсичностью. Здесь мы описываем эффективного анализа, который может использоваться для быстрого определения клеточной цитотоксичности и эффективность соединения против дикого типа и мутантных штаммов вируса. Желаемый целевой линии клеток высевали в 96-луночный планшет с и после 24 ч инкубации последовательно разведения тестируемых соединений добавлены. Никаких дополнительных манипуляций не требуется для сотовых цитотоксичность; для анти ВИЧ анализах заранее определенное количество либо WT или лекарственной устойчивостью ВИЧ-1 вектора, который экспрессирует люциферазы добавляют к клеткам. Цитотоксичность измеряется с помощью АТФ зависимую люминесценции анализа и воздействие соединений на инфекционность измеряется определением количества lucifeRase в присутствии или в отсутствие предполагаемых ингибиторов. Этот скрининг анализ занимает 4 дня, чтобы закончить и несколько соединения могут быть подвергнуты скринингу параллельно. Проводили скрининг соединений в трех экземплярах и данные нормированы на уровнях инфективность / СПС в отсутствии целевых соединений. Эта техника обеспечивает быстрое и точное измерение эффективности и токсичности потенциальных анти соединений ВИЧ.

Если анализ (рис. 1, шаги 1 и 2) была успешно выполнена, то значения люциферазы должна напоминать данные, представленные в таблице 2 Сканирование во всем диапазоне концентраций.; потенциально мощным соединение покажет увеличение активности люциферазы слева направо, и контроль должны иметь самый высокий активность люциферазы. Если активность люциферазы не превышает 0,1 Относительная люциферазы единиц (RLUS) во всем диапазоне концентраций, это обычно означает, что соединение убил клетки. Если данные люциферазы больше или равна 2,0 RLUS во всех серийных разведений, то соединения не были способны ингибировать ВИЧ-1 инфекции у испытанных концентрациях. Построение концентрацию соединений по сравнению процента ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph (табл. 3, часть А), после выполнения линейного регрессионного анализа, будет производить результаты, аналогичные т<html> шланг показано в таблице 3, часть Б <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Рисунок 1. Подготовка ВИЧ-1 вирусные штаммы и установки клеточной цитотоксичности и один тур анализы в отношении инфекционности. На стадии 1 293T клетки трансфицировали pNL4.3ΔEnv.LUC и VSV-G и выдерживают в течение 48 часов, чтобы произвести вирус 34 . Вирус собирали и хранили (замораживали при -80 ° С в аликвотах), пока он не используется в анализы в отношении инфекционности. На шаге 2, HOS клетки высевают в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 24 часов. Затем клетки предварительно инкубировали с серийными разведени ми тестируемых соединений в течение 3 часов, а затем инфицируют вирусом (или WT или лекарственной устойчивостью). После 48 ч инкубации активность люциферазы измеряют. le1.jpg &quot;ширина =&quot; 300 &quot;/&gt; Таблица 1. Наркотиками Скрининг серийного разведения Prototype. Более жесткими скрининга включает 11 серийных разведений, которые обычно начинаются в 10 мкМ и заканчиваются на 0,0005 мкМ. Серийные разведения готовятся 10x; Есть 100 мкл клеток и 100 мкл вируса в каждой лунке). В этом объеме и в соответствии этих расчетов, серийные разведения будет достаточно для 3 рядов целой 96-луночного планшета. На цитотоксичность готовятся аналогично; однако серийные разведения 11 начинаются от 250 мкм и заканчиваются в 0,05 мкм. Только 11 мкл разведений в лунки добавляют в пластине, которые содержат 100 мкл клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Таблица 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Таблица 2. Люциферазы сигнала считывания данных и определение процента ингибирования активности люциферазы. Таблица данных показывает типичный набор люциферазных данных для успешного соединения. В таблице также показаны дополнительные расчеты, необходимые для определения процента ингибирования активности люциферазы и CC 50 и IC 50 значений. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Таблица 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Таблица 3. Линейная регрессия Анализ данных таблицы. Часть. Графические диапазон концентраций, используемый по отношению к процент ингибирования активности люциферазы в Kaleidagraph будет производить соответствующие кривые ингибирования. Часть B, Кривые ингибирования определены три параметрическихсигмоидальная функция и нужным в данных по линейной регрессии анализирует 18. Эта таблица данные затем используются в сочетании с Microsoft Excel для расчета концентрации наркотиков, необходимые для подавления интеграции вируса и клеточной цитотоксичности на 50%, например, IC 50 и СС 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Здесь мы опишем клеточную цитотоксичность и один раунд анализы инфекционности, которые позволяют для быстрого и точного скрининга соединений с целью определения их клеточную цитотоксичность (CC 50) и значения ИК 50 против WT и прочной ВИЧ-1 препарата.

Быстрого скрининга ВИЧ обратной транскриптазы и ингибиторы интегразы

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Визуализация сотовый к клетке передачи ВИЧ-инфекции с помощью флуоресцентного клоны ВИЧ и жить конфокальной микроскопии

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Сочетание Клей-ленты на основе выборки и флуоресценции На месте Гибридизация для быстрого обнаружения Сальмонеллы На Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

В пробирке раздевания ВИЧ-1 сердечников

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Обратной генетики опосредованного восстановления инфекционных мышей норовирус

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Высокопроизводительный скрининг для широкого спектра химических ингибиторов РНК-содержащих вирусов

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Нуклеокапсидные отжига опосредованная электрофореза (NAME) Анализ позволяет быстро выявлять ВИЧ-1 нуклеокапсидные ингибиторов

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Система для эффективности и цитотоксичности скрининга ингибиторов Таргетинг внутриклеточных<em&gt; Микобактерии туберкулеза</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Пищевых патогенов скрининга с помощью магнитно люминесцентные нано: Быстрое обнаружение кишечной палочки O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Обнаружение и удаление нуклеиназы загрязнения во время очистки рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...