Name: rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Denna forskning stöds av Interna forskningsprogram av NCI.

1. Beredning av Mästare Stocks <ol><li> Gör ledar lager av de föreningar, som skall testas i DMSO. Förbered lagren på en standardkoncentration av 20 mM. Notera: någon koncentration över 10 mM kan användas. Föreningar som kan användas som positiva kontroller för att validera denna analys omfattar RAL, EVG, och DTG. </li><li> Säkerställa Föreningar upplöses i DMSO genom att vortexa lösningarna flera gånger under 15 sekunder och inkuberades vid RT under 1 timme. Lagra de 20 mM förrådslösningar i mörker vid -20 ° C fram till användning. </li></ol> 2. Framställning av 96-brunnars plattor för Förening Screening <ol><li> Välj den cellinje som skall testas (t.ex. HOS eller TZM-bl) och ympa 100 pl av dessa celler vid en densitet av 4 x 10 4 celler / ml (4000 celler / brunn) i medium (t ex Dulbeccos modifierade Eagle-eller DMEM-medium kompletterat med 5% (volym / volym) fetalt bovint serum, 5% nyfött kalvserum, och penicillin (50 enheter / ml) plus streptomycin). </li></ol> 3. Generation över viruslagren Producera VSV-G-pseudotypade HIV genom att transfektera 293-celler (som visas i figur 1, steg 1) från 32 till 34. <ol><li> På dagen före transfektion, tallrik 293 celler på 100 rätter mm diameter vid en täthet av 1,5 x 10 6 celler. </li><li> På dagen för transfektion, transfektera 293-celler med 16 pg av vildtyp eller mutant HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) och 4 ^ g av VSV (pHCMV-g) med användning av kalciumfosfatmetoden 35. </li><li> Ungefär 6 timmar efter den kalciumfosfatfällning sättes, tvätta 293 celler två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och inkubera med färskt medium under 48 timmar. [DMEM kompletterat med 5% (volym / volym) fetalt bovint serum, 5% nyfött kalvserum och penicillin (50 enheter / ml) plus streptomycin (50 | ig / ml)]. </li><li> Skörda viruset innehåller supernatanter genom att ta bort media från 100 mm diameterrätter, klargöra supernatanterna med låg hastighet centrifugering vid 3000 rpm i 10 minuter, filtrera supernatanterna genom en ìm porstorlek spruta 45 filter, behandla supernatanterna med Turbo DNas i 30 min vid RT och späd supernatanterna i medierna för beredning i infektionsanalyser . Förvara de virala supernatanterna frysta, i portioner, vid -80 ° C. Anmärkning: mängden av p24 i supematanten bestäms genom användning av en HIV-1 p24-enzym-linked immunosorbent assay kit. Den p24-koncentration används för att styra mängden virus i provet. Cirka 500 ng av virus sättes till HOS-celler utstrukna på disk 60 mm diameter vid en densitet av 1,5 x 10 5 celler / skål dagen före infektion. Efter 48 h av inkubation skördas cellerna, uppsamlades genom centrifugering, tvättades och återsuspenderades i 100 pl av PBS. Lägg till en lika stor mängd Luminescence reportergenanalys reagens och mäta luciferasaktivitet som beskrivs i avsnitt 5.4.1 och5.4.2. Från denna kan göras en lämplig utspädning av viruset såsom diskuteras i steg 4,6. </li></ol> 4. Förening Screening i 96-brunnsplattor Skärm varje förening i tre exemplar och det genomsnittliga resultatet. Anm: effekten av varje förening på viral replika korrigeras genom normalisering till nivån för replikering som erhölls i frånvaro av någon förening. <ol><li> Bestäm den empiriska koncentrationsintervall som ska screenas. Anm: typiskt är skärmar med 11 serieutspädningar gjordes av tillsats av föreningen till plattan kolumn för kolumn och skärmar med 7 serieutspädningar görs genom att tillsätta föreningen för rad. En tre exemplar uppsättning brunnar måste reserveras för någon förening kontroll. Dessutom måste en kolumn eller en rad vara tom för att fungera som den negativa / bakgrundskontroll. Slutligen, om det är en cellulär cytotoxicitet eller infektivitet assay kommer att diktera om viruset tillsättes. </li><li> Förberedserieutspädningar från 20 mM stamlösning. Koncentrationerna väljs beroende på ett experimentellt bestämt koncentrationsintervall, som skall testas (såsom visas i tabell 1). Förbered spädningar i media på 10x slutkoncentrationen önskas, det vill säga om den slutliga koncentrationen kommer att vara 100 ^ M, gör en 1 mM arbets lager. OBS: föreningar med IC 50 s över 5-10 mikroM är vanligtvis inte bra kandidater för läkemedelsutveckling. I de inledande analyserna testar vi de föreningar som bara mot WT vektorn. Lovande föreningar som effektivt inhiberar WT vektor testas sedan mot en panel av läkemedelsresistenta mutanter. </li><li> Ta bort de 96-brunnars plattor från inkubatorn och addera seriespädningar av de föreningar som skall testas till brunnarna i tre exemplar (såsom visas i figur 1, steg 2). Anm: volymen till brunnen bör vara 1/10 volym av den slutliga koncentrationen. Således till 22 l / brunn (slutlig volym pOST virus Dessutom är 220 l) för smittsamhet analyser. För cytotoxicitetsanalyser, tillsätt 11 | il / brunn (slutlig volym är 110 | il / brunn). </li><li> Returnera 96-brunnars plattor till inkubatorn. För en cellulär cytotoxicitet skärm, inkubera de 96 brunnar 48 timmar vid 37 ° C och inga ytterligare manipulationer behövs i protokoll 4: fortsätt till protokoll 5 för infektionsanalyser fortsätter du att följa anvisningarna i protokoll nr 4.. </li><li> Smittsamhet analyser endast. Avlägsna plattorna från inkubatorn efter ett minimum av 3 h inkubation vid 37 ° C med de föreningar som skall analyseras. Anmärkning: detta tillåter den förening som skall tas upp av cellerna före infektion med HIV-vektorn. </li><li> Förbered en aktieutspädning av viruset 33, 34 (vanligen ca 1:3) som kommer att ge en luciferas signal mellan 0,2-1,5 relativa luciferasenheter (RLU) i obehandlade celler. En hel platta kommer att ta ungefär 10 ml av utspädningsted viruset. Addera 100 pl av virus till varje brunn, med användning av antingen en 8 eller 12 flerkanalspipett. Lägg inte till viruset till de negativa / bakgrundskontrollbrunnar. Återgå plattorna till 37 ° C inkubator i 48 timmar. Anm: a 1:03 lager utspädning av viruset är typisk utspädning som kommer att producera ett luciferas signal mellan 0,2 -1,5 RLUs baserad på ett p24-analysen visar att den virala koncentrationen i supernatanten är ca 500 ng i 1,0 ml. </li></ol> 5. Beredning och Mätning av cytotoxicitet och smittsamhet i 96-hålsplattor <ol><li> Aspirera media från brunnarna (fenolrött i media kan störa luciferas signal). Använd en glaspipett med en 200 mikroliter pipettspets fäst vid änden. Börja längst upp i media och sakta arbeta ner mot det nedre hörnet av brunnen. Spendera inte för mycket tid på botten av brunnen, eller celler kan avlägsnas från brunnen. </li><li> Addera 100 pl av PBS kompletterad med 0,5 mM MgCl 2 till varje brunn. Detta måste göras omedelbart efter det att materialet har avlägsnats så att cellerna inte torkar ut. </li><li> Endast för cytotoxicitetsanalyser, tillsätt 5 ml substratbuffert från detekteringsanalys av Luminescence ATP till varje flaska med medföljande frystorkade reagens. En injektionsflaska är tillräckligt för en 96-brunnars platta. <ol><li> Addera 50 pl av cell-lys-buffert från detektionsanalysen Luminescence ATP till varje brunn. Skaka 96-brunnsplatta vid 700 rpm vid rumstemperatur under 5 min med användning av en kompakt Thermomixer. </li><li> Lägg till 50 l av rekonstituerad Luminescence ATP-analys detektionsreagens till alla brunnar utom de negativa styrning / bakgrundsbrunnar. Skaka vid 700 rpm vid rumstemperatur under 5 min med användning av en kompakt Thermomixer. Inkubera plattorna vid rumstemperatur under 20 min för att ge tid för signalutveckling. </li><li> Läs 96-brunnars platta med användning av mikroplattan luminometer. Obs: Öppna SoftMax Pro mikro luminometer program. Se till luminometem är inställd att mäta luminescence vid en känslighet på 5 avläsningar / brunn. </li></ol></li><li> Endast för infektionsanalyser, tillsätt 10 ml substratbuffert från Luminescence reportergenanalys till varje flaska med medföljande frystorkade reagens. En injektionsflaska är tillräcklig för varje 96-brunnsplatta. <ol><li> Addera 100 pl av rekonstituerad Luminescence reportergen analysreagens till varje brunn. Inkubera vid rumstemperatur under 20 min för att ge tid för signalutveckling. </li><li> Läs 96-brunnars platta med användning av en mikroplatt luminometer som utförs i avsnitt 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. Bestämning av CC 50 och IC 50-värden för föreningar <ol><li> Överför luciferas data från mikroplattan luminometer i ett Excel-ark. <ol><li> Genomsnittlig både de luciferas uppgifter i tre exemplar och signaluppgifter bakgrund / kontroll. Subtrahera den genomsnittliga signal bakgrund / kontroll från genomsnittet triplikat signalen för hela koncentrationsområdet. </li> &lt;li&gt; Normalisera bakgrundskorrigerade genomsnittliga signal för sträcker sig koncentrationen mot aktivitet, om det är cytotoxicitet eller infektivitet, i frånvaro av varje förening för att bestämma den procentuella inhiberingen. Notera: procentuell inhibering definieras som luciferasaktivitet i närvaro av läkemedel dividerat med luciferasaktivitet i frånvaro av läkemedlet, multiplicerat med 100. </li></ol></li><li> Använd Kaleidagraph programvara för att få CC 50 och IC 50-värden <ol><li> Överför både empiriskt bestämd koncentrationsområdet och procent hämning av luciferasaktivitet i Kaleidagraph. </li><li> Plotta data med koncentrationsintervall på x-axeln och den procentuella inhibitionen av luciferasaktivitet på y-axeln. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Vi beskriver en snabb, effektiv och reproducerbar analys som kan användas för att screena föreningar med avseende på cytotoxicitet och för deras förmåga att inhibera replikation av både WT och läkemedelsresistenta HIV-1. Förmågan att snabbt identifiera föreningar och testa deras effektivitet och cytotoxicitet är avgörande för utvecklingen av nya och förbättrade läkemedel mot HIV-1. När blyföreningar är identifierade, kan analoger av ledningen förening produceras och testas med hjälp av samma analys. Analysen är relativt enkel. Det finns både positiva och negativa kontroller som tillåter användaren att diagnostisera de vanligaste problemen (giftiga föreningar, problem med vektor lager). Användningen av en triplikat uppsättning brunnar utan tillsatt förening visar att virusinfektionen har inträffat. Att cytotoxicitet mäts i en oberoende analys undviker misstolkar en minskning av luciferas orsakad av cytotoxicitet som en särskild effekt på virusreplikation. De kritiska stegeni protokoll förbereder plattorna så att cellerna är enhetligt fördelade i brunnarna, att brunnarna har lämpliga koncentrationer av föreningarna som skall testas, tillsätta samma mängd virus till varje brunn, och mätning av luciferasaktiviteten till bestämma CC 50 och IC 50-värden. Analysen är säker, kvantitativ och reproducerbar. Analysen är säker eftersom vektorn är replikationsdefekt. Analysen är kvantitativt och reproducerbart eftersom det är baserat på en enda runda vektor som uttrycker luciferas, som kan analyseras exakt och enkelt. I en multi runda virusreplika assay, den uppmätta IC 50 beror på antalet av virala livscykler; detta är ett särskilt problem när analyserna involverar både WT och läkemedelsresistenta virus som kan ha väsentligt olika kapacitet replikering. Det har flera enzymatiska analyser tidigare rapporterat att kananvändas för att screena för IN-hämmare. Analyser som involverar realtids-PCR-teknik för att mäta integrerade DNA kräver renade rekombinanta proteiner (s), och är i allmänhet både mer arbetskrävande och dyrt 36, 37. Även om det är möjligt att använda enzymatiska analyser för att mäta effekten av föreningar på de andra virala enzymer (RT och proteas) kräver varje enzym dess egna analyssystemet. Den runda vektoranalys, som beskrivits, kan användas, utan ändringar, till skärmen för RT-hämmare. En liknande analys kan användas för att screena för proteashämmare; emellertid i en analys av proteas-hämmare, är föreningarna måste läggas till de celler som används för att producera vektorerna. En besläktad analys, med användning av olika celler och vektorer kan också användas för att screena med avseende på höljet (env) och HIV-inträde fusionshämmare. Slutligen kan analysen användas i större skala, med automatiserade robot automater. Sålunda kan analysen användas för att screena stora bibliotek av föreningar mot WT och mutant HIV. Men det faktum att analysen kan detektera en inhibitor av HIV-replikation som fungerar i olika stadier av den virala livscykeln pekar på en begränsning i att tolka data. Genom sig själv analysen inte definiera vilka steg i livscykeln är blockerad av en förening. Om detta uppstår frågan, kan det lösas genom att använda tiden för tillsats analyser 38, och genom att testa föreningen mot renade rekombinanta virusproteiner. Tyvärr, trots framgången med anti HIV-läkemedel, finns det fortfarande problem med både motstånd och toxicitet. I avsaknad av ett effektivt anti HIV-vaccin, det finns ett behov inte bara för att utveckla nya terapeutiska läkemedel som är effektiva mot de befintliga läkemedelsresistenta mutanter, men också för att utveckla förebyggande läkemedel som kan minska spridningen av viruset. Om profylaktisk användning av anti HIV-läkemedel incudes behandling av icke infekterade personer, kommer denna metod placerar en speciell belastning för utveckling av läkemedel som har little eller ingen långsiktig toxicitet.

Tillgången på läkemedel som riktar flera viktiga steg i HIV-1 virusets livscykel har lett till kombinationsläkemedelsbehandling (kallad högaktiv antiretroviral terapi, eller HAART) som kraftigt har förbättrat behandlingen av HIV-1-infektioner, och den långsiktiga överlevnaden av patienterna. HAART, som vanligtvis använder kombinationer av två nukleosid omvänt transkriptas (RT)-hämmare och antingen en proteashämmare eller icke-nukleosid RT-hämmare, har nu omvandlats en dödlig sjukdom i ett livslångt tillstånd 1-5. Men trots de många framgångarna av HAART i ihållande hämning av virusreplikation, den har begränsningar. HAART inte utrota hiv, så att patienterna inte botas, och behandlingen är livslång. Det finns problem med läkemedelstoxicitet och med uppkomsten av läkemedelsresistenta stammar. Resistens kan uppstå till alla godkända anti HIV-läkemedel, inklusive de nyligen godkända läkemedel som riktar HIV-integras (IN). Drogmotstånd sannolikt uppstår becaanvändning av spontana mutationer som inträffar under virusreplikation (felfrekvens på 3 x 10 -5 mutationer / bas / replikationscykeln) 6. När mutationer uppstår i de gener som kodar för målen för antiretroviral droger, kommer en liten delmängd av dessa mutationer leder till en minskad känslighet för virusstam till drogerna. För att undvika utveckling av resistens, måste läkemedelskoncentrationer hållas på nivåer som helt undertrycka HIV-replikation. Dålig vidhäftning till den terapeutiska regimen förvärrar problemet, och kan leda till en snabb utveckling av resistens 7-9. Även läkemedelskoncentrationer kan variera hos patienter på grund av olika absorption, metabolism, distribution och utsöndring nivåer, kan höga läkemedelskoncentrationer leda till toxicitet 10. Eftersom behandlingen fortsätter för livet av patienten, det finns allvarliga säkerhetsproblem om den långsiktiga toxicitet av anti retrovirals. Den anti retrovirals som vanligen används i HAART kan ha negativa effekter ennd det funnits incidenter där sidoeffekter är inte livshotande 11-15. Problemen patienter möter med resistensutveckling och toxicitet ligger bakom behovet av att utveckla nya läkemedel som effektivt blockerar replikation av de gemensamma resistenta stammar av viruset med liten eller ingen långsiktig toxicitet. Således finns det ett behov av en analys som kan screena för föreningar som snabbt blockerar väsentliga steg i den virala livscykeln. Här beskriver vi en effektiv analys som kan användas för att utvärdera cytotoxiciteten av en föreningarna och deras förmåga att blockera replikation av både WT och läkemedelsresistenta HIV-stammar snabbt och effektivt. Analysen vi använder liknar en analys som utvecklades för att screena för drogmotstånd i virus som isolerats från patienter 16-18. Även om analysen kan användas utan modifiering för att screena för föreningar som kan blockera HIV omvänd transkription, kommer vi att descrIBE använda analysen för att utvärdera IN-hämmare. I är ett väsentligt viralt enzym som infogar det virala DNA in i det cellulära genomet 19. Även om ett antal lovande inhibitorer utvecklas, av vilka en del genomgår för närvarande kliniska försök, bara Isentress 20, 21 (även känd som Raltegravir eller RAL) och på senare tid, Elvitegravir (EVG) 22 och Dolutegravir (DTG) 23 har godkänt av FDA. Dessa föreningar är aktiva mot både HIV B-och icke-B-subtyper i cellodling och i patienter 24, 25. Men behandling med RAL väljer för resistent HIV-1 IN mutanter, inklusive Y143R, N155H och G140S/Q148H 24, 26-31. N155H och G140S/Q148H också minska effekten av EVG, vilket understryker behovet av att utforma och utveckla andra generationen i Strand överföringshämmare (INSTIs) som är effektiva mot dessa resistensmutationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Även om ett antal anti HIV-läkemedel har godkänts, finns det fortfarande problem med toxicitet och läkemedelsresistens. Detta visar på ett behov av att identifiera nya substanser som kan hämma infektion av de vanligaste läkemedelsresistenta HIV-1-stammar med minimal toxicitet. Här beskriver vi en effektiv analys som kan användas för att snabbt bestämma den cellulära cytotoxiciteten och effekten av en förening mot WT och mutantvirusstammar. Det önskade målet cellinje ympades i en 96-brunnsplatta och, efter en 24 timmars inkubering, är seriespädningar av de föreningar som skall testas tillsätts. Inga ytterligare manipulationer är nödvändiga för cellulär cytotoxicitetsanalyser; för anti HIV-analyser för en förutbestämd mängd av antingen en WT eller läkemedelsresistent HIV-1-vektor som uttrycker luciferas sättes till cellerna. Cytotoxicitet mäts med hjälp av en ATP-beroende luminiscens analys och effekterna av föreningarna på smitt mäts genom att bestämma mängden luciferase i närvaro eller frånvaro av de förmodade inhibitorer. Detta screeninganalys tar 4 dagar att genomföra och flera föreningar kan screenas parallellt. Föreningar screenas i tre exemplar och data normaliseras till de smitt / ATP-nivåer i avsaknad av vilka substanser. Denna teknik ger en snabb och noggrann mätning av effekten och toxiciteten av potentiella anti HIV-föreningar.

Om analysen (Figur 1, steg 1 och 2) genomfördes framgångsrikt, då luciferas-värden bör likna de data som presenteras i tabell 2 skanna över koncentrationsområdet. ett potentiellt potent förening kommer att avslöja allt större luciferasaktivitet från vänster till höger, och kontrollen bör ha högsta luciferasaktivitet. Om luciferasaktiviteten inte överstiger 0.1 Relativa luciferasenheter (RLU) över koncentrationsområdet, betyder det oftast att föreningen dödade cellerna. Om luciferas data är större än eller lika med 2,0 RLU från alla seriespädningar, då de föreningar som inte var i stånd att hämma HIV-1-infektioner vid de testade koncentrationerna. Plottning av koncentrationen av föreningarna versus den procentuella inhiberingen av luciferasaktivitet i Kaleidagraph (tabell 3, avsnitt A), efter utförande av linjär regressionsanalys, kommer att producera liknande resultat till t<html> slang visas i tabell 3, del B. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Figur 1. Beredning av HIV-1 virus Aktier och inställnings av cellulär cytotoxicitet och Single-round Smittsamhet analyser. I steg 1, är 293T celler transfekterade med pNL4.3ΔEnv.LUC och VSV-G och inkuberas i 48 timmar för att producera virus 34 . Viruset skördades och lagrades (frystes vid -80 ° C i alikvoter) tills den används i infektiviteten analyser. För steg 2 är HOS-celler ympades i en 96-brunnsplatta och inkuberades i 24 timmar. Cellerna stryks sedan förinkuberades med seriespädningar av de föreningar som skall testas under 3 timmar och sedan infekterade med virus (antingen WT-eller läkemedelsresistent). Efter en 48 h inkubation luciferasaktiviteten mättes. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabell 1. Drug Screening Seriespädprototype. En striktare screening innebär 11 seriespädningar som vanligtvis börjar vid 10 ^ M och slutar vid 0,0005 pM. De seriespäd bereds 10x; det finns 100 | il av celler och 100 jil av virus i varje brunn). Vid denna volym och att följa dessa beräkningar kommer de serieutspädningar vara tillräckligt för tre rader av en hel 96-brunnar. De cytotoxicitetsanalyser bereds på samma sätt; Men de 11 seriespäd börjar vid 250 ^ M och slutar på 0,05 mikroM. Endast 11 l av spädningarna läggs till brunnarna i plattan som innehåller 100 pl celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Tabell 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabell 2. Luciferas signal dataavläsning och Fastställande av Procent hämning av luciferas aktivitet. Datatabellen visar en typisk uppsättning av luciferas uppgifter för en lyckad förening. Tabellen visar också de ytterligare beräkningar som behövs för att bestämma den procentuella hämningen av luciferasaktivitet och CC 50 och IC 50-värden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Tabell 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabell 3. Linjär regressionsanalys datatabellen. Del A. Plotta koncentrationsområdet används versus den procentuella inhiberingen av luciferasaktivitet i Kaleidagraph kommer att producera lämpliga hämningskurvor. Del B är den hämningskurvor definieras av 3 parametriskasigmoidal funktion och passform till data genom linjär regressionsanalys 18. Denna datatabell används sedan tillsammans med Microsoft Excel för att beräkna läkemedelskoncentrationer som krävs för att hämma virus integration och cellulär cytotoxicitet med 50%, till exempel IC 50 och CC 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Här beskriver vi cellulär cytotoxicitet och enkla runda smittsamhet analyser som möjliggör snabb och noggrann screening av föreningar för att bestämma deras cellulär cytotoxicitet (CC 50) och IC 50-värden mot WT och resistent HIV-1.

Snabb Screening av hiv omvänt transkriptas och Grashämmare

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Visualisera cell till cell överföring av hiv med fluorescerande kloner av hiv och Live konfokalmikroskopi

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating av HIV-1 kärnor

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Omvänd genetik Medierad Återvinning av infektiös Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

High-throughput screening för brett spektrum kemiska inhibitorer av RNA-virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nukleokapsid Annealing-medierad elektrofores (NAME) Analys Tillåter snabb identifiering av HIV-1 nukleokapsiden Hämmare

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

System för Efficacy och cytotoxicitet Screening av inhibitorer Inriktning Intracellulär<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Livsmedelsburna patogener Screening med Magneto-fluorescerande Nanosensor: Snabb påvisande av E. Coli O157: H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Upptäckt och borttagning Nuclease kontamination vid rening av rekombinant prototyp skummande Virus integras

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...