Name: best: barcode enabled sequencing of tetrads
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en NIH / NHGRI Genome Scholar / Faculty Transition Award (K22 HG002908) til AMD og et strategisk partnerskab mellem Institut for Systembiologi og University of Luxembourg. Anmodninger om stammer eller plasmider skal rettes til Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1.. Strain Byggeri og karakterisering <ol><li> Konstruere den heterozygote diploidstamme skal anvendes i indlægget ved at parre haploide stammer og vælge diploider 2 eller ved hjælp af en naturligt forekommende heterozygot stamme. Stammerne skal ikke havnen GFP. </li><li> Kontroller, at stammen er ude af stand til at vokse på YPD 2 + 200 ug / ml G418. </li><li> Bekræft, at stammen er i stand til at danne sporer. BEST er kompatibel med lave sporedannelsen effektivitet kors, men lav sporulation stigende frekvens FACS sortering tid, der kræves. <ol><li> Opsæt en O / N kultur af stammen i 5 ml YPD og vokse med omrøring ved 30 ° C. </li><li> Vask 0,5 ml O / N-kulturen tre gange med PBS (pH 7,4). </li><li> Pelleter vaskede celler, supernatanten fjernes, og resuspender i 2 ml sporulationsmedium 7. </li><li> Omrør celler ved RT og tjekke dagligt for tetrade formation ved hjælp af et fasekontrast lysmikroskop med en 40X objektiv. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Vurdere sporen levedygtighed korset ved konventionel dissektion 2,3 af et lille antal (~ 20) tetrader. Spore levedygtighed i krydsninger mellem forskellige stamme baggrunde varierer meget og uforudsigeligt. Dog kan a priori forventninger spore levedygtighed blive brugt til at vurdere effektiviteten af en BEST eksperiment forud for arbejdskraft-og omkostningskrævende skridt spare og genotypebestemmelse stammerne. Derfor er dette skridt stærkt anbefales. </li></ol> 2.. Transformation af diploider med Library of stregkode plasmider <ol><li> Sæt pCL2_BC barcoded plasmidet i heterozygot diploidstamme vha. transformationsprotokol er beskrevet i Gietz og Woods 8 med de følgende modifikationer. <ol><li> Efter cellerne er blevet inkuberet med omdannelsen blandingen ved 30 ° C i 20 minutter, tilsættes DMSO til 8% af volumenet af transformation mix. Tilsætning af DMSO er fundet at forbedre transformationseffektivitet in nogle strain baggrunde 9. </li><li> Efter heat shock trin, sammenpresse cellerne med en kort centrifugering dekanteres transformation blanding, og vask cellerne forsigtigt i YPD. Derefter opblande cellerne i 1 ml YPD og give dem mulighed for at komme sig ved stuetemperatur i 3 timer uden bevægelser. </li></ol></li><li> Vælg transformanter ved udpladning på YPD + G418 (200 ug / ml) agarplader. For at sikre en kompleks pulje af plasmid stregkoder, høste et stort antal kolonier, fx fem plader med ~ 2.500 kolonier per plade. </li><li> Når kolonier er synlige (2-3 dages vækst ved 30 ° C), pool transformanterne ved forsigtigt at skrabe dem ud af pladen i flydende YPD + G418 (200 ug / ml) + 15% glycerol. Vortex denne celle suspension, overførsel til en Cryokonserveringshætteglasset, og fryse ved -80 ° C. Lav en særskilt frossen bestand for hver plade. Disse frosne lagre tjener som udgangsstoffer stammer til trin 3.1 og kan også anvendes til at generere flere tetrader på et senere tidspunkt, hvis det ønskes. </li&gt; </ol> 3.. Sporedannende Bibliotek transformerede celler Anskaf Barcoded Tetrads <ol><li> Genoplive celler fra frosne lagre oprettet i 2,3 med O / N vækst i 5 ml YPD + G418 (200 ug / ml) ved 30 ° C under omrøring. </li><li> Vask cellerne fra O / N kulturer 3x i PBS (pH 7,4) og derefter resuspenderes cellerne i sporulationsmedium 7 plus 200 pg / ml G418. </li><li> Agitere sporulation kulturer ved RT og overvåge sporedannelsen fremskridt dagligt, indtil nye tetrader har stoppet formgivning. </li><li> Når kulturen indeholder velformede tetrader og relativt få dyader fjerne kulturer fra agitation og henstår ved stuetemperatur i mindst 7 dage. Mens nogle kors kan være modtagelig for på plade fordøjelse og forstyrrelser, så snart tetrader har dannet (vurderet som beskrevet i 7.3), den ekstra inkubation (7-10 dage i vores eksperimenter) er vigtig for andre kors. Derfor er dette skridt stærkt anbefales. </li></ol> 4.. EtablereFACS Gates for Tetrad Sorting Den meiotisk udtrykte SPS2-GFP-fusion på pCL2_BC plasmid tillader tetrader i sporuleringen kultur at blive opdaget og isoleret fra kulturen ved fluorescens. Følgende protokol er blevet udviklet for en FACSAria II. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. FACS porte. En serie af fire sekventielle porte anvendes til at isolere tetrader. De er vist i (A) porte og (B) til at reducere antallet af klumper. Fluorescerende begivenheder vælges med porten i (C). Histogrammet i (D) har to toppe. Begivenheder i venstre top er primært tetrader (venstre indsat billede), og begivenhederne i den rigtige top er generelt Tetrads med en vedhæftet opløbet (højre indsat billede). En endelig porten eranvendt på dette histogram til at vælge begivenheder som for det meste tetrader (røde søjler). Dette tal er blevet ændret fra Ludlow, et al 1.. <ol><li> Læg den sporulerede kultur på en FACS sorteringsanlæg og oprette to forward scatter og side scatter porte til at udelukke snavs, klumpet celler, og flere celler pr dråbe (figur 2A og 2B). </li><li> Der bør være en population af fluorescerende celler, som ved brug af SPS2-GFP reporter konstrukt omfatter dyader og tetrader 10. Gate GFP vs FSC at medtage disse fluorescerende hændelser (Figur 2C). </li><li> Afhængigt af stammen baggrund kan det være nødvendigt at indsætte en ekstra port til at fjerne klumper, der omfatter tetrader og andre celler. Hvis det er nødvendigt, inspicere en FSC histogram af de fluorescerende begivenheder og angive en port, der omfatter begivenheder med lavere FSC (figur 2D, gated begivenheder er i rødt). </li><li> Kontroller effektiviteten af ​​t<html> han gating regime ved at sortere ~ 1.500 tetrader på et objektglas og tælle andelen af ​​tetrader til ikke-tetrader ved hjælp af et fasekontrast mikroskop ved 400X forstørrelse. Procenten af ​​tetrader nøjagtigt kan anslås ved at tælle kun ~ 200 sorteret begivenheder, men sortering ~ 1.500 reducerer mængden af ​​tid brugt på at søge for celler på objektglasset. Alternativt kan forholdet mellem tetrader til ikke-tetrader vurderes i trin 4.5. </li><li> Kontrollér med jævne mellemrum, at sorteringsanlæg nøjagtigt rapporterer antallet af hændelser ved at sortere 25 tetrader på et objektglas og undersøge cellerne indeholdt i dråben ved hjælp af et fasekontrast mikroskop ved 400X forstørrelse. Der bør være 25 tetrader i dråben. Gentag 3-4x beregne variansen af ​​FACS-instrumentet. </li></ol> 5. Sortering Tetrads på en agarplade p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Fig. 3. Placering af agarplade på FACS sorter. At sortere tetrader i en lille dråbe af zymolyase anbringes opløsningen i midten af en standard (cirkulære) agarplade, en standard (100 mm firkantet) 96-brønds plade først placeret på scenen af ​​cellesorteringsapparatet og sorteringsanlæg er programmeret til at deponere tetrader ind i en bestemt godt (i dette tilfælde D5). Derefter er den cirkulære agarplade placeret på toppen af ​​96-brønds plade og justeret, således at dråbe zymolyase er centreret over den specificerede godt. <ol><li> Varm det ønskede antal YPD + G418 (200 ug / ml) plader i mindst 1,5 time i en 37 ° C inkubator anbragt nær FACS sorter. </li><li> Et centralt element i sorteringen protokollen er evnen til præcist at målrette FACS sorteres tetrader til et bestemt sted på en agarplade, der indeholder en pulje af zymolyase løsning. For at gøre dette, skal du placere en &quot;milepæl&quot; 96 brønde på than automatiseret celle deposition enhed (ACDU) i sorter. Forbered en slags layout, der vil sortere 25 tetrader i en brønd på en 96-brønds format. Vælg et godt nær midten af pladen, fx godt D5. Figur 3 viser en petriskål og 96-brønds plade fyldt på en cellesorterer. Sortering 25 tetrader per plade giver godt adskilte kolonier. </li><li> Bringe en stak af 10 agarplader fra 37 ° C inkubator til sorteringsanlægget. </li><li> Tag en agarplade og pipette 25 pi zymolyase-opløsning (1 mg / ml i 0,7 M sorbitol) på agar nær centrum af pladen. Derefter placeres pladen på den skelsættende plade med 96 brønde, som bringer zymolyase dråbe over målet godt fra trin 5.2, fx godt D5. </li><li> Start sortere og deponere 25 tetrader i midten af ​​zymolyase dråbe på agar. Derefter fjernes og dække pladen. </li><li> Gentag trin 5.4 og 5.5 indtil den 25. tetrader er blevet sorteret i Zymolyase dråber på hver plade i stakken. </li&gt; <li> Retur stakken af ​​tetrad-holdige plader på 37 ° C inkubator. </li><li> Gentag trin 5.3 gennem 5.7 indtil alle plader har tetrader. </li></ol> 6.. Adskillelse Spores <ol><li> Inkuber hver stak tetrad-agarplader ved 37 ° C i 1,5 timer. </li><li> Fjern pladerne fra inkubatoren, tilsættes 15-25 steril 3 mm glasperler per plade, og ryst pladerne som en skorsten (eller som to stakke af 5 plader) i 3-5 min. Den bedste Spore adskillelse opnås ved at flytte pladerne stift fra side til side eller front til tilbage. Flyt ikke pladerne, således at den perler &quot;hvirvel&quot; omkring yderkanten af ​​pladen. Lad perlerne på pladerne når du er færdig. </li><li> Placer stakken af ​​plader med perler står op i en 30 ° C inkubator. Hent den næste stak plader fra 37 ° C inkubator, og gentag trin 6.2. </li><li> Pladerne inkuberes O / N ved 30 ° C. </li></ol> 7.. Høst Colonies <ol><li> Efteren O / N inkubation ved 30 ° C, bør små kolonier dannet på pladerne. Fjern forsigtigt pladerne fra inkubatoren uden at forstyrre glasperler. </li><li> Fjern glasperlerne ved omhyggeligt og hurtigt at vende pladerne i en dyb beholder. Beholderen skal være dybt nok til at fange perlerne uden at tillade dem at hoppe op og ramte agarpladen. Hvis du trykker på bunden af ​​pladen, mens det er omvendt kan hjælpe løsne perler, der sidder fast på pladen. Disse perler kan genbruges af grundig vask med sæbe, skylle godt med deioniseret vand og sterilisering ved autoklavering. </li><li> Tæl antallet af kolonier på hver plade og bruge antallet af kolonier at vurdere effektiviteten af ​​Spore adskillelse og genvinding. For eksempel kunne 25 tetrader per plade til et kors med nær levedygtighed 100% udbytte i alt 100 kolonier per plade. </li><li> Fra plader med et tilstrækkeligt antal kolonier (&gt; 65 for en høj rentabilitet krydser), overføre celler fra hver colony i en separat brønd i en 96-brønds plade indeholdende YPD flydende + G418. Også, skal du notere hvilke huller indeholder kolonier fra samme agar plade; disse oplysninger vil blive brugt til at hjælpe tetrad opgaven software. </li><li> Brug 96-brønds flydende plader til frø kulturer til genotypebestemmelse og til lagring stammer som frosset glycerolstamopløsninger. Oplysninger om RAD-tag sekventering og sekvensanalyse kan findes i Ludlow et al 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Mange områder af genetik forskning, der spænder fra komplekse træk kortlægning 11 til undersøgelse af underliggende mekanismer for DNA-rekombination 12, kræver ekstremt store antal afkom, og store mængder af DNA-sekventering. Teknikker, gifte magt konventionelle metoder med en kapacitet på high throughput DNA-sekventering har potentiale til at muliggøre undersøgelser, der tidligere var umedgørlig. Selv om der er anvendt en række high-throughput gærgenetik metoder effektivt til specifikke problemer, hver har sine begrænsninger, der ligger under den brede anvendelighed af konventionel tetrad analyse. BEDSTE adresser disse udfordringer ved at ansætte en high-throughput tilgang, der kombinerer tetrad dissektion og genotypebestemmelse afkom af gær kors. I forbindelse med multiplex RAD-tag sekventering, BEST tilbyder en billig måde at indsamle genotype oplysninger for hver afkom stamme samtidig bevare tetrad relationer ved hjælp af unikke tetrad stregkoder.0; Af alle i øjeblikket anvendes høje throughput metoder BEST bedst rekapitulerer de oplysninger, som en manuelt dissekeret gær kors. BEST har to vigtige funktioner. Den første er brugen af ​​FACS til hurtigt isolere tetrader væk fra unsporulated celler i kultur (Protokol trin 5-6). Evnen til at isolere tusindvis af fluorescerende begivenheder (tetrader) giver BEST sin største gevinst i gennemløb. Denne automatisering giver en endnu større fordel i forhold til manuel dissektion for krydsninger med lav sporedannelse effektivitet, på grund af den øgede nødvendige tid til visuelt at identificere sjældne hændelser. Den anden centrale element er brugen af ​​en meget kompleks molekylær stregkode (Protokol trin 2), der overføres til hver søster spore en tetrad. Fordi disse stregkoder kan anvendes til beregningsmæssigt rekonstruere tetrad relationer mellem sporer, der er tilfældigt fordelt over en agarplade, behovet for manuelt at array-celler i en ordnet gitter lindres. Endeligfordi den molekylære stregkode og sporuleringen-specifikke GFP-reportergenet er fysisk forbundet (på det samme plasmid), der kun tetrader, der har bevaret den molekylære stregkode udvalgt af FACS-sortering. Der er to forhold, der styrer den tid, at kulturer inkuberes i sporulationsmedium. For det første fordi sporuleringen specifikke reporter (SPS2-GFP) udtrykkes tidligt i meiose, GFP alene ikke skelner komplet 4-Spore tetrader fra celler, som ikke er afsluttet meiose (dvs. dyader). Mens yderligere FACS gating kan nedsætte antallet af fluorescerende, ufuldstændige tetrader, er den nemmeste måde at mindske disse uønskede hændelser blot overvåge sporuleringen kultur (Trin 3.3) og fortsætter gang nye tetrader har stoppet formgivning. I vores eksperimenter, hyppigheden af ​​dyader sorteret er mindre end 1%. For det andet, for nogle kors ekstra tidsforbrug i sporulationsmedium ved RT uden omrøring (Trin 3.4) Sigligt forbedrer adskillelsen af ​​tetrader af glasperler under plating ((Protokol Trin 6). Faktisk er absolut nødvendigt for afbrydelse af nogle kors dette trin. Ligesom alle høje throughput metoder BEST er &quot;støjende&quot; end den tilsvarende konventionelle tilgang. Den beskedne reduktion i effektiviteten af ​​BEST forhold til konventionelle tetrad dissektion kan skyldes kombinationer af flere faktorer. En faktor er øget tab af ellers levedygtige sporer, som kunne opstå ved vedhæftning til glasperlerne under spredning eller øget spore død på grund af mekaniske påvirkninger af processen. En anden faktor kan være simple plasmid tab under meiose. En tredje faktor kan være et effektivt fald i brugbare kolonier som følge af kolonier med blandede genotyper, en anslået ~ 5% af kolonier i vores pilot krydser 1. Det er sandsynligt, at disse kolonier repræsenterer fiaskoer søster spore adskillelse. Fordi den hurtige fluoratorescence sortering og spore separation tillader indsamling af et enormt antal tetrader, der er bedst rustet til at overvinde fald i effektiviteten på denne skala. Mens fremtidige gentagelser af BEST kunne øge effektiviteten nærmer sig manuel dissektion, er det måske mere sandsynligt, at den nuværende eksponentielle bane af DNA-sekventering kapacitet hurtigt vil kompensere for dette niveau af brugbar stamme tab. Uanset hvad, vil evnen til at udføre tetrad analyse på skalaen, som bedst kan anvendes aktivere undersøgelser, der i øjeblikket umuligt ved manuelle metoder.

Meiotisk genkortlægning, almindeligvis kendt som tetrad analyse, er centralt for gær genetik. Kort fortalt er der to haploide stammer, der hver indeholder en enkelt kopi af hvert kromosom, parret til at danne en heterozygot diploidstamme med to kopier af hvert kromosom, en fra hver forælder. Sultende diploide celler for kvælstof inducerer meiose (sporedannelsen), hvori kromosomer duplikere, undergår omlejring, og opdele i fire haploide celler (sporer eller segreganter) med nye kombinationer af alleler fra hver forælder. De fire sporer som følge af en enkelt meiose kan isoleres ved en manuel proces, der kaldes tetrad dissektion. Konventionel tetrad dissektion 2,3, som har ændret sig lidt siden den oprindelige udgivelse i 1937 4, har tre mål. For det første skal celler, der har gennemgået meiose (tetrader) isoleres fra en baggrund af vegetative celler. I konventionel analyse, opnås dette ved en forsker, som, ved hjælp afet mikroskop, visuelt identificerer tetrader på en agarplade og beskæftiger en mikromanipulator apparat visuelt identificere tetrader på en agarplade og ved hjælp af en mikromanipulator at flytte tetrade på en celle-fri område af pladen. Dernæst skal de fire sporer i tetrad være fysisk adskilt for at forhindre interspore parring. Sporer inden for en tetrade holdes sammen af både en ASCUS, rest af cellevæggen af den oprindelige diploide celler, og et sæt af interspore broer 5. I konventionel tetrad analyse ASCUS fjernes ved enzymatisk nedbrydning, og en forsker bruger mikromanipulator at bryde interspore broer og drille hinanden sporerne. Endelig er de individuelle sporer iført en gitret mønster, der opretholder forholdet mellem de sporer, dvs alt afkom i en række af fire er søster sporer af den samme oprindelige tetrade. En erfaren gær forsker kan fuldføre processen med at dissekere 10 tetrader (en almindeligt accepteret mindste antalper kryds) i cirka 15 minutter. Vi har udviklet en ny high-throughput tetrad genotypebestemmelse metode, som vi kalder B arcode E nabled S equencing af T etrads (BEST) 1.. BEDSTE udvider de nuværende metoder i high-throughput genetik ved at muliggøre generering og genotypebestemmelse af et stort antal afkom, der er isolerede, genotypede, og føres som individer i en måde, der gør det muligt for søster spore relationer alle fire meiotiske produkter, der skal inddrives. Dette opnås ved hjælp af tre strategier (figur 1). Først er indførelsen af ​​et reportergen-konstrukt, som mærker celler, der har undergået meiose med GFP og tillader dem at isoleres ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Andet er inkorporeringen af ​​et meget komplekst DNA stregkode (en streng af 15 tilfældige nucleotider) i en form, der sendes til alle fire sporer af en tetrade og kan læses ved hjælp af DNA-sekventering af det rekombinante Progeny og dermed identificerer søster sporer fra samme tetrad. Tredje er genotypebestemmelse skridt, og BEST er kompatibelt med mange genotypebestemmelse platforme at fange både et sæt af genomiske markører samt tetrade-specifik stregkode. Vi anvender et restriktionssted-associeret DNA-tag-sekventering (RAD-seq) 6 metode, der dirigerer genomsekventering til specifikke restriktionssteder 1, derved at indfange en konsekvent 2-3% af genomet i afkom-stammer såvel som plasmid-bårne stregkode . Genopretningen af ​​tetrad relationer sammen med den empirisk-afledt genotypebestemmelse data fra korset tillader præcis følgeslutning af manglende oplysninger, herunder status for markører med lav sekvens dækning og komplette genotype er levedygtige (og derfor uoprettelige) individer. Her beskriver vi anvendelse af metoden i de mest almindeligt anvendte mikroorganisme til meiotisk kortlægning gæren S. cerevisiae. Men med mindre substitutioner af organisme-specifikke REAherretoilettet, fx forskellige sporulation-specifikke proteiner fusioneret til GFP, bør metoden være let overføres til andre mikroorganismer, herunder organismer, i hvilke meiotisk kortlægning er betydeligt mere arbejdskrævende eller aktuelt umedgørlig. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figur 1. Bedste metode. (A) pCL2_BC plasmidet er et 2-micronplasmid med sporulering specifikke GFP-fusion, modstandsdygtighed over for G418, og en 15-mer tilfældige stregkode. Konstruktion af plasmid-bibliotek er beskrevet i Ludlow et al 1. (B) En pulje af stregkodede plasmider transformeres til diploidstamme indlæg. (C) Transformanter dyrkes derefter om udvælgelse og ~ 10.000 transformerede kolonier samles og sporuleret. Under meiose hver spore en tetrade arver en copy af barcoded plasmid. (D) Tetrads er adskilt fra unsporulated celler ved FACS og opsamlet på agarplader, hvor de er fordøjet og forstyrret at hver spore til at danne en koloni. (E) Kolonier derefter plukkes i 96-brønds plader, fænotypebestemt og genotype. Under genotypebestemmelse læses plasmidet stregkoden og anvendes til at identificere de fire medlemmer af hver tetrade. Dette tal er blevet ændret fra Ludlow m.fl. 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Tetrad analyse er et værdifuldt redskab for gær genetik, men den besværlige manuelle karakter af processen har hindret dens anvendelse på store skalaer. Stregkode Aktiveret Sekventering af Tetrads (BEST) 1 erstatter de manuelle processer til isolering, forstyrre og afstand tetrader. BEST isolater tetrader medfør af en sporulering-specifik GFP-fusionsproteinet, der muliggør fluorescens-aktiveret celle sortering af tetrader direkte på agarplader, hvor ASCUS enzymatisk fordøjet og sporerne sprængte og tilfældigt array af glasperle plating. De haploide kolonier tildeles derefter søster spore relationer, dvs oplysninger om, hvilke sporer stammer fra den samme tetrad, ved hjælp af molekylære stregkoder læses under genotypebestemmelse. Ved at fjerne en flaskehals i manuel dissektion, kan hundredvis eller endda tusindvis af tetrader isoleres på få minutter. Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af de eksperimentelle procedurer, der kræves for at udføre bedst i gærSaccharomyces cerevisiae, begyndende med en heterozygot diploidstamme gennem isolering af kolonier afledt af haploide meiotiske afkom.

BEDSTE kan i høj grad forbedre den hastighed, hvormed sporer fra tetrader kan isoleres. Som et eksempel på gennemløbet denne metode kan levere, en forsker udført FACS-sortering og spore separation (trin 5.1 til 6.3) med 149 agarplader i 3 timer 1. En tilsvarende udbytte (ca. 3.725 tetrader) ville kræve mere end 90 timers manuel dissektion. Men som med mange high throughput metoder, den aktuelle iteration af fremgangsmåden har vist tab af effektivitet i forhold til manuel dissektion. Dette tab manifesterer sig som et reduceret antal kolonier inddrives forhold til forventningen beregnet på grundlag af Spore levedygtighed korset, bestemt ved manuel dissektion (Trin 1.4). Antages det, at årsagerne til spore tab (Diskussion) påvirker sporer tilfældigt, kan skøn være lavet af, hvor mange genvundne kolonier vil være medlemmer af tetrader hvor 1, 2, 3, eller 4 sporer er blevet inddrevet (Figur 4). Figur 4.. Simulering af metode effektiviteten på tetrade plan. Manglende succes genoprette sporer (som kolonier) kan skyldes spore inviability, spore vedhæftning til glasperlerne, svigt at adskille sporer fra hinanden osv. binomial fordeling blev anvendt at beregne det forventede fraktion af tetrader (med mindst én succes tilbagebetales spore) producerer 4, 3, 2 eller 1 kolonier baseret på andelen af ​​alle sporer succes tilbagebetales. Denne graf kan tjene som en grov guide til antallet af stammer, der i sidste ende vil blive samlet i 3 - eller 4 - Spore tetrader. Da antallet af kolonier per plade stiger, så gør antallet af hele tetrader inddrives. I beskrev eksperimentet ovenfor 25 tetrader fra et kors med Spore levedygtighed tæt på 100% (som itermined ved manuel dissektion) 1 blev udpladet på 149 agarplader. I dette eksperiment er det maksimale antal af kolonier iagttaget pr pladen var 80, hvilket indikerer, at 20 sporer undladt at danne diskrete kolonier. Det gennemsnitlige antal kolonier pr pladen var 62. Kolonier fra de 61 plader indeholdende 65 kolonier eller flere blev høstet og sekventeret. Af de 3.700 stammer, der passerede sekventering kvalitetskontrol, kunne 72% være beregningsmæssigt tildelt i 3 - eller 4 - spore tetrader.

Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Stregkode Aktiveret Sekventering af Tetrads (BEST) erstatter de manuelle processer til at isolere, forstyrre og afstand tetrader. BEST isolater tetrader ved fluorescens-aktiveret cellesortering på agarplader adskiller sporerne ved omrøring med glasperler, og bestemmer, hvilke tilfældigt opstillede kolonier blev afledt fra den samme oprindelige tetrade hjælp molekylære stregkoder.

BEDSTE: Stregkode Enabled Sekventering af Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Detektion af sjældne genomiske varianter fra poolet sekventering under anvendelse Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kortlægning Bakterielle Funktionelle Networks og spredningsveje i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Hjælp Syntetiske Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifikation af protein-komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Næste generations sekventering af 16S ribosomalt RNA Gene Amplikoner

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Målrettet DNA methyleringsanalyse by Next generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forstærkning, Næste generations sekventering, og Genomisk DNA Kortlægning af retroviral integration steder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' enden sekventering bibliotek forberedelse med A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering af 3D hvidt fedtvæv struktur ved hjælp af hele-mount farvning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Vurdering af de metaboliske virkninger af Isokalorisk 2:1 intermitterende faste i mus

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...