Name: best: barcode enabled sequencing of tetrads
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en NIH / NHGRI Genome Scholar / Fakultet Transition Award (K22 HG002908) til AMD og et strategisk partnerskap mellom Institute for Systems Biology og University of Luxembourg. Forespørsler om stammer eller plasmider kan rettes til Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

En. Sil Bygg og karakterisering <ol><li> Konstruer heterozygot diploid stamme som skal brukes i den tverr ved å parre haploide stammer, og valg av diploider 2 eller ved hjelp av en naturlig forekommende heterozygot belastning. Stammene bør ikke havna GFP. </li><li> Se etter at stammen er i stand til å vokse på YPD 2 + 200 ug / ml G418. </li><li> Bekreft at stammen er i stand til å sporulate. BEST er kompatibel med lave sporulation effektivitet kors, men lav sporulation frekvensen øker FACS sortering tiden som kreves. <ol><li> Sett opp en O / N kultur av stammen i 5 ml YPD og vokse under omrøring ved 30 ° C. </li><li> Vask 0,5 ml av O / N kultur tre ganger med PBS (pH 7,4). </li><li> Pellet vaskede celler, fjern supernatanten, og resuspender i 2 ml sporulation medium 7. </li><li> Agitere celler på RT og sjekker daglig for tetrad dannelse ved hjelp av en fase kontrast lys mikroskop med en 40X objektiv. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Estimer spore levedyktighet av innlegget ved konvensjonell disseksjon 2,3 av et lite antall (~ 20) av tetrads. Spore levedyktighet i kors mellom ulike stammebakgrunn varierer mye og uforutsigbart. Imidlertid kan a priori forventninger til spore levedyktighet brukes til å vurdere effektiviteten av et BEST eksperiment før arbeids-og kostnadskrevende trinn på sparing og genotyping stammene. Derfor er dette trinnet anbefales. </li></ol> 2. Transformasjon av diploider med Library of strekkodet Plasmider <ol><li> Sett pCL2_BC strekkodet plasmid inn i heterozygot diploid stamme ved bruk av transformasjonsprotokollen beskrevet i Gietz og Woods 8 med de følgende modifikasjoner. <ol><li> Etter at cellene er blitt inkubert med transformasjonsblandingen ved 30 ° C i 20 min, tilsett DMSO til 8% av volumet av transformasjonsblandingen. Tilsetning av DMSO er funnet å forbedre effektivitet i transformasjonenn noen strekk bakgrunn 9. </li><li> Etter varmesjokk trinn, pellet cellene med en kort sentrifugering, dekanter transformasjonsblandingen, og vaske cellene forsiktig i YPD. Deretter, resuspender cellene i 1 ml YPD og tillate dem å gjenvinne ved RT i 3 timer uten omrøring. </li></ol></li><li> Velg transformanter ved utsåing på YPD + G418 (200 ug / ml) agarplater. For å sikre en kompleks pool av plasmid strekkoder, høste et stort antall kolonier, for eksempel fem plater med ~ 2500 kolonier per plate. </li><li> Når kolonier er synlige (2-3 dagers vekst ved 30 ° C), basseng trans ved forsiktig å skrape dem av platen inn i væsken YPD + G418 (200 ug / ml) + 15% glycerol. Vortex denne cellen suspensjon, overføre til en nedfrysing hetteglass, og fryse ved -80 ° C. Lag en egen frossen lager for hver plate. Disse frosne bestander tjene som start stammer for trinn 3.1, og kan også brukes til å generere flere tetrads på et senere tidspunkt, hvis det er ønskelig. </li&gt; </ol> Tre. Sporulating Library of transformerte celler skaffer strekkodet Tetrads <ol><li> Gjenopplive celler fra frossen fisk som er opprettet på 2,3 ved O / N vekst i 5 ml YPD + G418 (200 pg / ml) ved 30 ° C med omrøring. </li><li> Vask cellene fra O / N kulturer 3x i PBS (pH 7,4) og deretter resuspender cellene i sporulering medium 7 pluss 200 pg / ml G418. </li><li> Agitere sporulation kulturer på RT og overvåke sporulation fremgang hver dag frem til nye tetrads har sluttet å danne. </li><li> Når kulturen inneholder velformede tetrads og relativt få dyads, fjerne kulturer fra agitasjon og la ved RT i minst 7 dager. Mens noen kors kan være mottakelig for på plate fordøyelsen og forstyrrelser så snart tetrads har dannet (målt som beskrevet i 7.3), er avgjørende for andre krysser den ekstra inkubasjon (7-10 dager i våre eksperimenter). Derfor er dette trinnet anbefales. </li></ol> 4. EtablereFACS Gates for Tetrad Sorting Den meiotically uttrykt SPS2-GFP fusjon på pCL2_BC plasmid tillater tetrads i sporulation kultur for å bli oppdaget og isolert fra kulturen ved fluorescens. Den følgende protokoll er blitt utviklet for en FACSAria II. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. FACS-porter. En serie på fire sekvensielle portene blir brukt til å isolere tetrads. Resultatene vist i (A) porter og (B) for å redusere antallet av klumper. Fluorescent hendelser er valgt med glideren i (C). Histogrammet i (D) har to topper. Hendelser i venstre topp er primært tetrads (venstre innfelt bilde), og hendelser i riktig peak er generelt tetrads med et vedlagt knopp (høyre innfelte bildet). En endelig gate erbrukt på dette histogrammet til å velge hendelser som stort sett tetrads (røde søyler). Dette tallet har blitt forandret fra Ludlow, et al en. <ol><li> Laste sporulated kultur på en FACS sorter og satt opp to termin scatter og side scatter porter å utelukke rusk, klumpet seg celler, og flere celler per dråpe (Tall 2A og 2B). </li><li> Det bør være en befolkning på fluorescerende celler, som når du bruker SPS2-GFP reporter konstruere inkluderer dyads og tetrads 10. Gate GFP vs FSC å inkludere disse fluorescerende hendelser (figur 2C). </li><li> Avhengig av belastningen bakgrunn kan det være nødvendig å inkludere en ytterligere port for å fjerne klumper som omfatter tetrads og andre celler. Hvis dette er nødvendig, inspisere en FSC histogram av de fluorescerende hendelser og angi en gate som inkluderer hendelser med lavere FSC (figur 2D, gated hendelsene er i rødt). </li><li> Kontroller effektiviteten av t<html> han gating regime ved å sortere ~ 1500 tetrads på et objektglass og telle andelen tetrads til ikke-tetrads bruker en fase kontrast mikroskop ved 400x forstørrelse. Den prosent av tetrads kan beregnes nøyaktig ved å telle bare ~ 200 sortert hendelser, men sortering ~ 1500 reduserer mengden av tid brukt på å lete etter celler på objektglass. Alternativt, kan forholdet mellom tetrads til ikke-tetrads bli vurdert i trinn 4.5. </li><li> Kontroller med jevne mellomrom at sorter er nøyaktig rapportering antall hendelser ved å sortere 25 tetrads på et objektglass og undersøke cellene som finnes i dråpene ved hjelp av en fase kontrast mikroskop ved 400x forstørrelse. Det bør være 25 tetrads i dråpen. Gjenta 3-4x å vurdere variasjonen av FACS instrument. </li></ol> 5. Sortering Tetrads på en agarplate p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Fig. 3. Plassering av agarplate på FACS sorter. For å sortere tetrads inn i en liten dråpe av Zymolyase oppløsningen plassert i midten av en standard (sirkulær) agar plate, en standard (100 mm rektangulær) 96-brønns plate er først plassert på stadiet av cellesorterer og sortereren er programmert til å sette tetrads inn i en bestemt brønn (i dette tilfellet D5). Deretter blir den sirkulære agar plate plassert på toppen av 96-brønns plate og innrettet slik at slipp av Zymolyase er sentrert over den spesifiserte godt. <ol><li> Varm ønsket antall YPD + G418 (200 ug / ml) plater i minst 1,5 timer i en 37 ° C inkubator plassert i nærheten av FACS sorter. </li><li> Et viktig trekk ved sorterings protokollen er evnen til å nøyaktig målrette FACS sortert tetrads til et bestemt sted på en agar plate som inneholder en pool av Zymolyase løsning. For å gjøre dette, plassere en &quot;landemerke&quot; 96-brønns plate på than automatiserte celle deponering enhet (ACDU) av sorter. Forbered en slags layout som vil sortere 25 tetrads inn ett godt av en 96-brønns format. Velg en brønn i nærheten av midten av platen, f. eks vel D5. Figur 3 viser en petriskål og 96-brønns plate som er lagt inn en cellesorterer. Sortering 25 tetrads per plate gir godt adskilt kolonier. </li><li> Ta en stabel av 10 agarplater fra 37 ° C inkubator i sortereren. </li><li> Ta en agar plate, og pipetter 25 pl av Zymolyase-oppløsning (1 mg / ml i 0,7 M sorbitol) på agar nær sentrum av platen. Deretter plasserer platen på landemerket 96-brønns plate, samkjøre Zymolyase dråpe over målet godt fra trinn 5.2, f.eks vel D5. </li><li> Start sortere og deponere 25 tetrads inn mot midten av Zymolyase dråpe på agarplate. Deretter fjerner og dekker plate. </li><li> Gjenta trinn 5,4 og 5,5 inntil 25 tetrads har blitt sortert i Zymolyase dråper på hver plate i bunken. </li&gt; <li> Returstabelen tetrad holdige platene til en 37 ° C inkubator. </li><li> Gjenta trinn 5,3 gjennom 5,7 til alle platene har tetrads. </li></ol> 6. Utskilling Spores <ol><li> Inkuber hver stabel av tetrad-holdige agarplater ved 37 ° C i 1,5 timer. </li><li> Fjern platene fra inkubatoren, tilsett 15-25 sterile 3 mm glassperler per plate, og riste platene som en stabel (eller som to stabler med 5 plater) i 3-5 min. Den beste spore separasjon oppnås ved å bevege platene stivt fra side til side eller forsiden til baksiden. Ikke flytt platene slik at perlene &quot;virvel&quot; rundt ytterkanten av platen. La perlene på platene når du er ferdig. </li><li> Plasser platestabelen med perler med forsiden opp i en 30 ° C inkubator. Hente de neste stabel plater fra 37 ° C inkubator, og gjenta trinn 6.2. </li><li> Inkuber platene O / N ved 30 ° C. </li></ol> 7. Høst Colonies <ol><li> Etteren O / N inkubering ved 30 ° C, bør ha små kolonier dannet på platene. Fjern forsiktig platene fra inkubatoren, uten å forstyrre de glassperler. </li><li> Fjern glassperlene ved forsiktig og raskt å snu platene opp over en dyp beholder. Beholderen skal være dypt nok til å fange perler uten å tillate dem å sprette opp og traff agar plate. Tapping bunnen av tallerkenen mens det er omvendt kan hjelpe løsne perler som sitter fast til platen. Disse perler kan bli gjenbrukt ved grundig vask med såpe, skylles godt med avionisert vann og sterilisering ved autoklavering. </li><li> Tell antall kolonier på hver plate, og bruke det antall kolonier for å beregne effektiviteten av spore separasjon og utvinning. For eksempel kan 25 tetrads per plate for et kors med nær 100% levedyktighet gir totalt 100 kolonier per plate. </li><li> Fra plater med tilstrekkelig antall kolonier (&gt; 65 for en high-levedyktighet kryss), overføre celler fra hver fargeny inn i en separat brønn av en 96-brønners plate inneholdende YPD-væske + G418. Også gjøre oppmerksom på hvilke brønner inneholde kolonier fra samme agar plate; denne informasjonen vil bli brukt til å hjelpe tetrad oppdraget programvare. </li><li> Bruk 96-vel flytende plater til frø kulturer for genotyping og for lagring av stammer som frossen glyserol aksjer. Detaljer om RAD-tag sekvensering og sekvensanalyse kan bli funnet i Ludlow et al en. </li></ol>

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Mange områder av genetisk forskning, som strekker seg fra kompleks egenskap mapping 11 for å studere mekanismene bak DNA-rekombinasjon 12, krever et svært høyt antall avkom og store volumer av DNA-sekvensering. Teknikker som gifter seg med kraften i konvensjonelle tilnærminger med kapasiteten på høy gjennomstrømming DNA-sekvensering har potensial til å muliggjøre studier som tidligere var problematiske. Selv om flere high-throughput gjær genetikk metoder har blitt brukt effektivt til spesifikke problemer, har hver begrensninger som faller kort av bred anvendelse av konvensjonell tetrad analyse. BESTE adresser disse utfordringene ved å ansette en høy gjennomstrømming tilnærming som kombinerer tetrad disseksjon og genotype avkom av gjær kors. I forbindelse med multiplexed RAD-tag sekvensering, tilbyr BEST en billig måte å fange opp genotype informasjon for hver avkom belastning samtidig bevare tetrad relasjoner ved hjelp av unike tetrad strekkoder.0; Av alle i dag brukes store gjennomgangs metoder, tettest sammenfatter BEST informasjonen som gis av en manuelt dissekert gjær kryss. BEST har to viktige funksjoner. Den første er ved bruk av FACS for å raskt isolere tetrads bort fra unsporulated celler i kultur (Protocol trinn 5-6). Muligheten til å isolere tusenvis av fluorescerende hendelser (tetrads) gir BEST sin største gevinst i gjennomstrømningen. Dette automatisering gir en enda større fordel i forhold til manuell disseksjon for krysninger med lav sporulering effektivitet, på grunn av den økte tiden som er nødvendig for visuelt å identifisere sjeldne hendelser. Den andre viktig trekk er bruken av en meget kompleks molekyl strekkode (Protocol Trinn 2), som blir overført til hver søster spore av en tetrad. Fordi disse strekkodene kan bli brukt til å rekonstruere de beregningsmessig tetrad forhold mellom sporene som er tilfeldig fordelt over en agar plate, behovet for manuell matrisecellene i et ordnet gitteret er unødvendig. Endeligfordi den molekylære strekkode og sporulering spesifikke GFP reporter-genet er fysisk koblet (på det samme plasmid), blir bare tetrads som har beholdt den molekylære strekkode valgt av FACS-sortering. Det er to hensyn som styrer hvor lang tid at kulturer skal inkuberes i sporulation medium. Først, fordi sporulering spesifikk rapportør (SPS2-GFP) er uttrykt tidlig meiose, GFP alene skiller ikke komp 4-spore tetrads fra celler som ikke har fullført meiose (dvs. dyads). Mens ekstra FACS gating kan redusere antall fluorescerende, ufullstendige tetrads, er den enkleste måten å redusere disse uønskede hendelser rett og slett overvåke sporulation kultur (Step 3,3) og fortsetter gang nye tetrads har sluttet å danne. I våre eksperimenter, er frekvensen av dyads sortert mindre enn 1%. For det andre, for noen kors ekstra tidsbruk i sporulation medium ved RT uten agitasjon (Step 3,4) significantly forbedrer separasjonen av tetrads av glassperlene under pletter ((Protocol trinn 6). Faktisk er absolutt nødvendig for at forstyrrelse av noen krysser dette trinnet. Som alle store gjennomgangs metoder, er BEST &quot;støy&quot; enn tilsvarende konvensjonelle tilnærming. Den beskjeden reduksjon i effektivitet av BEST sammenlignet med konvensjonell tetrad disseksjon kan resultere fra kombinasjoner av flere faktorer. En faktor er den økte tap av ellers levedyktige sporer, som kan følge av adhesjon til glassperlene under spredning eller økt spore død på grunn av de mekaniske påkjenninger i prosessen. En annen faktor kan være enkelt plasmid tap under meiose. En tredje faktor kan være en effektiv reduksjon i brukbare kolonier som følge av kolonier med blandede genotyper, anslagsvis ~ 5% av koloniene i vår pilot krysser en. Det er sannsynlig at disse koloniene representerer feil av søster spore separasjon. Fordi den raske fluorescence sortering og spore separasjon tillate innsamling av enorme antall tetrads, er BEST godt rustet til å overvinne nedgang i effektivitet på denne skalaen. Mens fremtidige gjentakelser av BEST kunne øke effektiviteten nærmer seg manuell disseksjon, er det kanskje mer sannsynlig at den nåværende eksponentielle banen DNA-sekvense kapasitet vil raskt kompensere for dette nivået av brukbare belastning tap. Uansett, vil evnen til å utføre tetrad analyse på skalaen som BEST kan påføres aktivere undersøkelser som for tiden er drivverdige ved manuelle metoder.

Meiotisk genet kartlegging, vanligvis kjent som tetrad analyse, står sentralt i gjær genetikk. Kort fortalt, er to haploide stammer, som hver inneholder en enkeltkopi av hvert kromosom, paret for å danne et heterozygot diploid stamme med to kopier av hvert kromosom, en fra hver av foreldrene. Sulter diploide celler for nitrogen induserer meiose (sporulation) hvor kromosomer duplisere, gjennomgår omorganisering, og dele inn i fire haploide celler (sporer eller segregants) med nye kombinasjoner av alleler fra hver av foreldrene. De fire sporene som følge av en enkelt meiose kan isoleres ved en manuell prosess som kalles tetrad disseksjon. Konvensjonell tetrad disseksjon 2,3 som har endret seg relativt lite siden den opprinnelige utgivelsen i 1937 fire, har tre mål. For det første må celler som har gjennomgått meiose (tetrads) isoleres fra en bakgrunn av vegetative celler. Ved konvensjonell analyse, oppnås dette ved en forsker som, ved hjelpet mikroskop, identifiserer visuelt tetrads på en agar plate, og benytter en mikromanipulator apparat visuelt identifisere tetrads på en agar plate, og ved hjelp av en mikromanipulator for å bevege tetrad på en celle-frie område av platen. Deretter må de fire sporene i tetrad separeres fysisk å forhindre interspore parring. Sporene i en tetrad blir holdt sammen av både en ascus, som er blitt igjen i celleveggen av den opprinnelige diploid celle, og et sett med interspore broer 5. I konvensjonell tetrad analyse ascus fjernes ved enzymatisk fordøyelse, og en forsker bruker mikromanipluatoren å bryte interspore broer og erte hverandre sporene. Til slutt blir de individuelle sporer oppstilt i et gittermønster som opprettholder forholdet mellom sporene, det vil si alt avkom på en rad av fire er søster sporer av samme original tetrad. En erfaren gjær forsker kan fullføre prosessen med å dissekere 10 tetrads (en allment akseptert minimum antallper kryss) i ca 15 min. Vi har utviklet en ny high-throughput tetrad genotyping metode, som vi kaller B ARCODE E nabled S equencing av T etrads (BEST) en. BEST utvider på dagens metoder i high-throughput genetikk ved å muliggjøre produksjon og genotyping av et stort antall avkom som er isolert, genotypet, og vedlikeholdes som individer på en måte som gjør at søsterspore relasjoner av alle fire meiotisk produkter som skal gjenvinnes. Dette oppnås ved bruk av tre hovedstrategier (figur 1). Først er innføring av en reporter konstruksjon som etiketter celler som har gjennomgått meiose med GFP og tillater dem å bli isolert ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). For det andre er inkorporering av en meget kompleks DNA strekkode (en streng av 15 tilfeldige nukleotidene) i en form som blir overført til alle fire sporer av en tetrad, og kan leses av DNA-sekvensering av det rekombinante Progeny og dermed identifiserer søstersporer fra samme tetrad. For det tredje er den genotyping trinn, og det beste er kompatible med en rekke genotyping plattformer som fanger opp både et sett av genomiske markører samt tetrad spesifikke strekkode. Vi benytter et restriksjonssete-assosierte DNA-sekvense tag (RAD-seq) 6 Fremgangsmåte som dirigerer genom sekvense til spesifikke restriksjonsseter 1, for derved å fange en konsistent 2-3% av genomet av avkom-stammer, så vel som plasmid-båret strekkode . Utvinningen av tetrad forbindelser sammen med empirisk avledet genotyping data fra korset tillater nøyaktig slutning av manglende informasjonen, inkludert status for markører med lav sekvens dekning og den komplette genotypen til inviable (og derfor uopprettelig) individer. Her beskriver vi anvendelse av fremgangsmåten på den mest brukte mikroorganisme for meiotisk kartlegging, gjæren S. cerevisiae. Men med mindre erstatninger av organismen spesifikke reagents, for eksempel ulike sporulation spesifikke proteiner smeltet til GFP, skal metoden være lett overførbar til andre mikroorganismer, inkludert organismer der meiotisk kartlegging er betydelig mer arbeidskrevende eller nåværende problematiske. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figur 1. Beste metoden. (A) pCL2_BC plasmid er en 2-mikron-plasmidet med en sporulering spesifikk GFP fusjon, motstand mot G418, og en 15-mer tilfeldig strekkode. Bygging av plasmidet biblioteket er beskrevet i Ludlow et al en. (B) En pool av strekkode plasmider er forvandlet til den diploide belastningen fra et kryss. (C) Transformanter blir så dyrket på utvalget og ~ 10 000 transformerte kolonier blir slått sammen og sporulated. Under meiose hver spore av en tetrad arver en copy av strekkodet plasmid. (D) Tetrads separeres fra unsporulated celler ved FACS og samlet på agar-plater, hvor de blir fordøyd og forstyrret for å tillate hver spore for å danne en koloni. (E) Kolonier blir så plukket inn i 96-brønners plater, phenotyped og genotypet. Under genotype plasmidet strekkode leses og brukes til å identifisere de fire medlemmene i hver tetrad. Dette tallet har blitt forandret fra Ludlow et al en. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Tetrad analyse er et verdifullt verktøy for gjær genetikk, men arbeidskrevende manuell innholdet i prosessen har hindret sin søknad på store skalaer. Barcode Enabled Sekvensering av Tetrads (BEST) en erstatter manuelle prosesser for å isolere, forstyrre og avstands tetrads. Best isolerer tetrads i kraft av en sporulering spesifikk GFP fusjonsprotein som muliggjør fluorescens-aktivert cellesortering tetrads direkte på agarplater, der ascus enzymatisk fordøyd og sporene er avbrutt og tilfeldig kledd med glassperler plating. De haploide koloniene blir deretter tildelt søsterspore relasjoner, det vil si informasjon om hvilke sporer stammer fra samme tetrad, ved hjelp av molekylære strekkoder lest under genotyping. Ved å fjerne flaskehalsen for manuell disseksjon, kan hundrevis eller kanskje tusenvis av tetrads bli isolert i løpet av minutter. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av de eksperimentelle prosedyrer som kreves for å utføre BEST i gjærSaccharomyces cerevisiae, og starter med et heterozygot diploid stamme ved isolering av koloniene avledet fra haploid meiotisk avkom.

BEST kan forbedre hastigheten som sporer fra tetrads kan isoleres. Som et eksempel på gjennomstrømming denne metoden kan levere, en forsker utførte FACS sortering og spore separasjon (trinn 5.1 gjennom 6.3) med 149 agar plater i 3 hr en. En tilsvarende yield (ca 3725 tetrads) vil kreve mer enn 90 timer av manuell disseksjon. Imidlertid, som med mange høy gjennomstrømning metoder, har de nåværende gjentakelse av fremgangsmåten noe tap av effektivitet i forhold til manuell disseksjon. Dette tapet manifesterer seg som et redusert antall kolonier utvinnes i forhold til forventningen beregnet basert på spore levedyktighet av korset, bestemmes av manuell disseksjon (Step 1,4). Forutsatt at årsakene til spore tap (Diskusjon) påvirker sporer tilfeldig, kan beregninger foretas for hvor mange kolonier gjenvunnet vil være medlemmer av tetrads hvori ett, to, tre eller fire sporer er blitt gjenvunnet (figur 4). Fig. 4. Simulering av metoden effektivitet ved tetrad nivå. Unnlatelse av å kunne gjenopprette sporer (som kolonier) kan skyldes spore inviability, spore adhesjon til glassperler, manglende evne til å skille sporer fra hverandre, etc. Binomialdistribusjon ble brukt for å beregne den forventede brøkdel av tetrads (med minst én hell gjenspore) fremstilling 4, 3, 2 eller 1 kolonier basert på andelen av alle sporer med hell gjenopprettet. Dette diagram kan tjene som en grov veiledning til antall stammer som til syvende og sist vil bli satt sammen til 3 - eller 4 - spore Tetrads. Som antall kolonier per plate øker, øker også antall hele tetrads gjenvunnet. I forsøket som er beskrevet ovenfor, 25 tetrads fra et kors med spore levedyktighet nær 100% (pr. Determined ved manuell disseksjon) 1 ble belagt på 149 agar plater. I dette forsøk, det maksimale antall kolonier per plate ble observert 80, noe som indikerer at 20 sporer ikke klarte å danne avgrensede kolonier. Gjennomsnittlig antall kolonier per plate var 62 år. Colonies fra de 61 platene som inneholder 65 kolonier eller flere ble høstet og sekvensert. Av de 3700 stammer som passerte sekvense kvalitetskontroll, kan 72% være beregningsmessig inndelt i 3 - eller 4 - spore tetrads.

Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Barcode Enabled Sekvensering av Tetrads (BEST) erstatter manuelle prosesser for å isolere, forstyrre og avstands tetrads. BEST isolerer tetrads av fluorescens-aktivert celle sortering på agar plater, skiller sporene etter agitasjon med glassperler, og bestemmer hvilke tilfeldig kledd kolonier ble avledet fra samme opprinnelige tetrad ved hjelp av molekylære strekkoder.

BEST: Barcode Enabled Sekvensering av Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Påvisning av sjeldne genomisk Varianter fra Pooled Sekvensering Bruke Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartlegging Bakteriell Funksjonelle nettverk og veier i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Ved hjelp av syntetisk Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifisering av protein komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Med sekvensiell Peptide affinitetsrensing i kombinasjon med tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Neste-generasjons sekvensering av 16S ribosomalt RNA Gene amplikonene

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Målrettet DNA Metylering Analyse av Neste-generasjons sekvense

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Forsterkning, Neste generasjons sekvensering, og Genomisk DNA Kartlegging av Retrovirale Integrasjons nettsteder

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3 slutten sekvensering biblioteket forberedelser med A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Vurdering av metabolske effekter av Isocaloric 2:1 intermitterende Fasting i mus

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...