Name: best: barcode enabled sequencing of tetrads
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH / NHGRI Геном Академия / факультет переходный премии (K22 HG002908) в AMD и стратегического партнерства между Института системной биологии и Университета Люксембурга. Запросы на штаммов или плазмид должны быть направлены на Aimée Дадли (aimee.dudley @ gmail.com).

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Многие направления исследований генетики, начиная от комплексного картографирования признака 11 к изучению механизмов, лежащих в основе рекомбинации ДНК 12, требуют чрезвычайно большое количество потомства и большие объемы секвенирования ДНК. Методы, которые вступают в брак силу традиционных подходов с мощностью высокой пропускной последовательности ДНК имеют потенциал, чтобы исследования, которые ранее были неразрешимыми. Хотя несколько высокой пропускной методы дрожжей генетики были эффективно применены к конкретным проблемам, каждый из них имеет ограничения, которые не достигают широкой применимости обычной тетрадного анализа. ЛУЧШИЕ решает эти задачи за счет использования высокой пропускной подход, сочетающий тетрадный рассечение и генотипирования потомство дрожжей крестов. В сочетании с мультиплексированном RAD-тега секвенирования, ЛУЧШИЙ предлагает недорогой способ собрать информацию генотип для каждого штамма потомства при сохранении тетрадного отношения с помощью уникальных тетрадных штрих-кодов.0; Из всех в настоящее время используется высокие методы пропускной, ЛУЧШИЙ наиболее тесно повторяет информацию, представленную вручную расчлененного креста дрожжей. ЛУЧШИЙ имеет две ключевые особенности. Первый состоит в использовании FACS быстро изолировать тетрады от unsporulated клеток в культуре (Протокол шаги 5-6). Возможность изолировать тысячи люминесцентных событий (тетрад) дает ЛУЧШИЙ наибольшее усиление пропускной способности. Этот автоматизации обеспечивает еще большее преимущество по сравнению с ручным вскрытия для скрещивания с низкой эффективностью споруляции, в связи с увеличением времени, необходимого для визуального определения редких событий. Функция второй ключ является использование очень сложной молекулярной штрих-кода (Протокол Шаг 2), которая передается каждому сестра споры о тетрады. Поскольку эти штрих-коды можно использовать для реконструкции в вычислительном тетрады отношения между спорами, которые были случайным образом распределены по чашке с агаром, необходимость вручную массива ячеек в упорядоченной сетки облегчены. Наконец,потому что молекулярная штрих-кода и ген GFP репортер споруляции конкретных физически связаны (на той же плазмиде), всего тетрады, которые сохранили молекулярную штрих-кода выбираются FACS сортировки. Есть два соображения, которые регулируют длительность времени, что культуры должны инкубируют в споруляции среды. Во-первых, потому что споруляция конкретных репортер (SPS2-GFP) выражается в начале мейоза, в одиночку GFP не различает полные 4-спор тетрады из клеток, которые не завершенных мейоза (т.е. диад). В то время как дополнительная СУИМ стробирования может уменьшить количество люминесцентных, неполных тетрад, самый простой способ, чтобы уменьшить эти нежелательные события просто мониторинг споруляции культуры (Шаг 3.3) и исходя раз новые тетрады прекратили формирования. В наших экспериментах, частота диад, отсортированных составляет менее 1%. Во-вторых, в течение некоторого кресты дополнительного времени, проведенного в спорообразования среде при комнатной температуре без перемешивания (Шаг 3.4) сиговыхчительно улучшает разделение тетрадах на стеклянных шариков во время посева ((Протокол Шаг 6). На самом деле, этот шаг является абсолютно необходимым для разрушения некоторых крестах. Как и все высокие методов пропускной, ЛУЧШИЙ является &quot;шумнее&quot;, чем соответствующий традиционного подхода. Умеренное снижение эффективности лучше по сравнению с обычной тетрадного вскрытия может быть результатом комбинации нескольких факторов. Одним из факторов является повышенное выпадение из противном случае жизнеспособных спор, который может возникнуть в результате прилипания к стеклянных шариков во время расширения или увеличения спор смерти из-за механических напряжений процесса. Второй фактор может быть простым потери плазмиды во время мейоза. Третьим фактором может стать эффективным уменьшение используемых колоний в результате колоний со смешанными генотипов, по оценкам, ~ 5% от колоний в нашей пилота пересекает 1. Вполне вероятно, что эти колонии представляют неудачи разделения спор сестра. Потому что быстрое плавиковыйценции сортировки и разделения спор позволить сбор огромного числа тетрад, ЛУЧШИЙ хорошо оборудована, чтобы преодолеть снижение эффективности по данной шкале. В то время как будущие итерации лучших могли повысить эффективность приближается к ручной вскрытия, это, пожалуй, более вероятно, что нынешний экспоненциальный траектория ДНК секвенирования мощности будет быстро компенсировать этот уровень полезной потери натяжения. Несмотря на это, возможность выполнять тетрадный анализ по шкале, в которой ЛУЧШИЙ могут быть применены позволит исследований, которые в настоящее невозможным ручными способами.

Мейотических отображение ген, известный как тетрадного анализа, занимает центральное место в дрожжевых генетики. Вкратце, два гаплоидных штаммов, каждый из которых содержит одну копию каждой хромосомы, в паре с образованием гетерозиготное диплоидный штамм с двумя копиями каждой хромосомы, по одному от каждого родителя. Голодающие диплоидных клеток для азота вызывает мейоза (споруляция), в котором хромосомы дублировать, пройти перегруппировку, и разделить на четыре гаплоидных клеток (спор или сегрегантов) с новыми комбинациями аллелей от каждого родителя. Четыре споры, вытекающие из одного мейоза может быть выделен с помощью ручного процесса, называемого тетрад рассечение. Обычные тетрада рассечение 2,3, который практически не изменился с момента первой публикации в 1937 году 4, имеет три цели. Во-первых, клетки, которые подверглись мейоза (тетрад) должны быть изолированы от фоне вегетативных клеток. В обычном анализе, это достигается путем исследователя, который, используямикроскоп, визуально идентифицирует тетрады на чашке с агаром, и использует микроманипулятор аппарат визуально идентифицировать тетрады на чашке с агаром, и с помощью микроманипулятор для перемещения тетраду на область бесклеточной пластины. Далее, четыре споры в тетрады должны быть физически разделены во избежание interspore спаривания. Споры внутри тетрады скрепляются как в сумке, оставшихся в клеточной стенке оригинального диплоидной клетке, и набор interspore мостов 5. В обычной тетрадного анализа аск удаляется путем ферментативного пищеварения, и исследователь использует микроманипулятор сломать interspore мосты и дразнить друг от друга споры. Наконец, отдельные споры облеченные в решетчатой ​​узором, который поддерживает связь между спорами, то есть все потомство в ряду четырех являются сестра споры той же исходной тетрады. Опытный дрожжи исследователь может завершить процесс рассечения 10 тетрады (общепринятая минимальное количествоза крест) в 15 мин. Мы разработали новую высокой пропускной метод тетрада генотипирования, которое мы называем Б arcode E nabled S equencing Т etrads (BEST) 1. ЛУЧШИЙ расширяет текущих методов в высокой пропускной генетики, позволяя генерацию и генотипирование большого количества потомства, которые изолированы, генотипированных, и поддерживается как лиц и организаций в манере, которая позволяет сестринские споры отношения всех четырех мейотических продуктов, которые будут восстановлены. Это достигается с помощью трех основных стратегий (рис. 1). Во-первых, это введение репортерной конструкцией, которая маркирует клетки, которые подверглись мейоза с GFP и позволяет им быть изолированы с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS). Во-вторых, включение очень сложной штрих-кода ДНК (строка 15 случайных нуклеотидов) в форме, которая передается на все четыре спор тетрады и может быть прочитан секвенирования ДНК рекомбинантного Progenу и, таким образом, определяет родственные спор из одной тетрады. В-третьих, это шаг генотипирование, и ЛУЧШИЙ совместим с многочисленными генотипирования платформ, которые захватывают и набор геномных маркеров, а также тетрада конкретных штрих. Мы используем сайт рестрикции ДНК-ассоциированной последовательности тэгов (RAD-SEQ 6) метод, который направляет секвенирование генома с конкретными сайтами рестрикции 1, тем самым захватывая последовательную 2-3% генома штаммов потомства, а также плазмиду переносимых штрих-кода . Восстановление тетрадных отношений наряду с эмпирически-производного генотипирования данных с креста позволяет точно вывод о недостающей информации, в том числе статуса маркеров с низким охватом последовательности и полного генотипа нежизнеспособных (и, следовательно, не читается) лиц. Здесь мы описываем применение метода в наиболее часто используемых микроорганизма для мейоза картография, дрожжей S. CEREVISIAE. Тем не менее, с незначительными замен организма конкретного Ригоспода, например, различные споруляции-специфических белков, слитые с GFP, метод должен быть легко воспроизведению в других микроорганизмов, в том числе организмы, в которых мейотическое отображение значительно более трудоемким или в настоящее время неразрешимыми. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Рисунок 1. Лучший метод. (А) pCL2_BC плазмиды является 2-мкм плазмиды с спорообразования конкретных GFP слияния, устойчивость к G418, и в 15-мерной случайной штрих-кода. Построение плазмиды библиотеки описано в Ludlow и др. 1. (В) пул штрих плазмид превращается в диплоидной деформации от креста. (C) Трансформанты затем выросли на выбор и ~ 10000 трансформированных колоний объединяют и спорулировались. Во время мейоза каждая спор из тетрады наследует совместноеру из штрих плазмиды. (D) Tetrads отделены от unsporulated клеток путем FACS и собирали на чашках с агаром, где они перевариваются и разрушали, чтобы каждый спор, чтобы сформировать колонии. (E) Колонии затем определена в 96-луночных планшетах, phenotyped, и генотипирование. Во генотипирования плазмида штрих считывается и используется для идентификации четырех членов каждой тетрады. Эта цифра была изменена с Ладлоу и др. 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Тетрадного анализа является ценным инструментом для дрожжевых генетики, но кропотливая ручная характер процесса препятствовал его применение в больших масштабах. Штрих Enabled Секвенирование тетрад (BEST) 1 заменяет ручной процессы выделения, нарушая и расстояние тетрады. ЛУЧШИЙ изолирует тетрады в силу споруляции конкретных GFP слитого белка, который обеспечивает флуоресцентно-активированном сортировки клеток тетрад непосредственно на чашках с агаром, где аск ферментативно переваренных и споры разрушенных и случайным образом, выстроенных на стеклянной бусины обшивки. Гаплоидного колонии затем присваивается сестра спор отношения, т.е. информация о которых споры возник из той же тетрады, с использованием молекулярных штрих-кодов для чтения во время генотипирования. Удаляя узкое ручного вскрытия, сотни или даже тысячи тетрад могут быть выделены в считанные минуты. Здесь мы представляем подробное описание экспериментальных процедур, необходимых для выполнения лучших в дрожжахSaccharomyces CEREVISIAE, начиная с гетерозиготной диплоидной процедить через изоляцию колоний, полученных из гаплоидного мейоза потомства.

ЛУЧШИЙ может значительно улучшить скорость, с которой споры с тетрад могут быть выделены. В качестве примера пропускной этот метод может поставить, один исследователь выполнял FACS сортировки и разделение спор (шаги 5,1 через 6,3) с 149 чашках с агаром в 3 ч. 1. Эквивалентно доходности (около 3725 тетрады) потребует более 90 ч ручного вскрытия. Тем не менее, как и во многих методов высокой пропускной, текущая итерация метода имеет некоторую потерю эффективности по сравнению с ручной вскрытия. Эта потеря проявляется как уменьшается количество колоний восстановился по сравнению с ожиданием, вычисленным по спор жизнеспособности кресте, определяемой ручного вскрытия (Шаг 1.4). Если предположить, что причины потери спор (обсуждение) влияют споры наугад, оценки могут быть сделаны от того, сколько восстановленные колонии будут членами тетрад, в котором 1, 2, 3 или 4 споры были восстановлены (рис. 4). Рисунок 4. Моделирование эффективности метода на уровне тетрадного. Failure для успешного восстановления споры (как колоний) может быть связано с спор нежизнеспособности, спор адгезией к стеклянных шариков, неспособность отделить споры друг от друга, и т.д. был использован биномиального распределения для расчета ожидаемой доли тетрад (по крайней мере с одной успешно восстановленной споры) получение 4, 3, 2 или 1 колонии на основе доли всех спор успешно восстановлены. Этот график может служить в качестве приблизительного ориентира к числу штаммов, которые в конечном итоге будут собраны в 3 - или 4 - спор тетрады. По мере увеличения числа колоний на чашку растет, растет число полных тетрад восстановлены. В описанном выше эксперименте, 25 тетрады от креста с спор жизнеспособности близка к 100% (как опрermined вручную вскрытия) 1 высевали на чашки с агаром 149. В этом эксперименте максимальное количество колоний, наблюдаемых на пластине было 80, что указывает на 20 спор не удалось образовывать дискретные колонии. Среднее число колоний на чашку было 62. Колонии от 61 чашках, содержащих 65 или более колоний собирали и секвенировали. Из штаммов 3700, которые прошли контроль качества секвенирования, 72% могут быть назначены в вычислительном 3 - или 4 - спор тетрады.

Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Штрих Enabled Секвенирование тетрад (BEST) заменяет ручные процессы выделения, нарушая и расстояние тетрады. ЛУЧШИЙ изолирует тетрады с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток на чашках с агаром, отделяет споры при перемешивании со стеклянными шариками, и определяет, какие случайно выстроенные колонии были получены из того же исходного тетрады с использованием молекулярных штрих-кодов.

ЛУЧШИЙ: Штрих Enabled Секвенирование тетрад

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Конкурентные Геномная Экраны Barcoded Библиотеки дрожжей

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Выявление редких геномных вариантов с помощью секвенирования Объединенные SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Сопоставление бактериальных функциональных сетей и путей в<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Использование синтетических генетических массивы

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Следующее поколение Секвенирование 16S рибосомальной РНК генов ампликонов

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Целевые метилирования ДНК Анализ Следующее поколение Секвенирование

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' конца последовательности подготовки библиотека с A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Оценка метаболических эффектов изокалорийного 2:1 Прерывистый пост у мышей

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...