Name: best: barcode enabled sequencing of tetrads
Uploaded: 2014-05-01T15:00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

Detta arbete stöddes av en NIH / NHGRI Genome Scholar / Fakulteten Transition Award (K22 HG002908) till AMD och ett strategiskt samarbete mellan Institutet för systembiologi och universitetet i Luxemburg. Begäran om stammar eller plasmider bör riktas till Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).

1. Sila Konstruktion och karakterisering <ol><li> Konstruera heterozygota diploida stammen som skall användas i tvär genom parning haploida stammar och välja diploider 2 eller med användning av ett naturligt förekommande heterozygot stam. Stammarna bör inte hysa GFP. </li><li> Bekräfta att stammen inte kan växa på YPD 2 + 200 pg / ml G418. </li><li> Bekräfta att stammen kan sporulera. BEST är kompatibel med låga sporulation effektivitets kors, men låg sporulering frekvensen ökar FACS sortering tid som krävs. <ol><li> Skapa ett O / N kulturen av stammen i 5 ml YPD och växa under omröring vid 30 ° C. </li><li> Tvätta 0,5 ml av O / N-kulturen tre gånger med PBS (pH 7,4). </li><li> Pellets tvättade cellerna, avlägsna supernatanten och återsuspendera i 2 ml sporuleringen mediet 7. </li><li> Skaka celler vid RT och kolla dagligen för tetrad bildning med hjälp av en fas kontrast ljusmikroskop med ett 40X objektiv. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Uppskatta spor livskraft korset genom konventionell dissektion 2,3 av ett litet antal (~ 20) av tetrads. Spore livskraft i korsningar mellan olika stambakgrund varierar kraftigt och oförutsägbart. Dock kan a priori förväntningar spor livskraft användas för att utvärdera effektiviteten av en BEST experiment innan de arbets-och kostnadskrävande åtgärder för att spara och genotypning stammarna. Därför är detta steg rekommenderas starkt. </li></ol> 2. Transformation diploider med Library of Barcoded plasmider <ol><li> Sätt i pCL2_BC streckkods plasmiden i heterozygota diploida stammen med användning av transformationsprotokollet beskrivet i Gietz och trän 8 med följande modifieringar. <ol><li> Efter att cellerna har inkuberats med transformationsblandningen vid 30 ° C under 20 min, tillsätt DMSO till 8% av volymen av transformationsblandningen. Tillsats av DMSO har visat sig förbättra transformationseffektiviteten in vissa belastnings bakgrunder 9. </li><li> Efter värmechocksteg, pellets cellerna med en kort centrifugering, dekantera transformationsblandningen, och tvätta cellerna försiktigt i YPD. Sedan, återsuspendera cellerna i 1 ml YPD och tillåta dem att återhämta sig vid rumstemperatur under 3 h utan omröring. </li></ol></li><li> Välj transformanter genom plätering på YPD + G418 (200 pg / ml) agarplattor. För att säkerställa en komplex pool av plasmid-streckkoder, skörda ett stort antal kolonier, t.ex. 5 plattor med ~ 2500 kolonier per platta. </li><li> När kolonier är synliga (2-3 dagars tillväxt vid 30 ° C), pool trans genom att försiktigt skrapa bort dem från plattan i flytande YPD + G418 (200 mikrogram / ml) + 15% glycerol. Vortex denna cellsuspension, överför till en kryokonserveringsflaskan, och frysa vid -80 ° C. Gör en separat fryst lager för varje platta. Dessa frysta lagren fungerar som startstammar för steg 3.1 och kan även användas för att generera fler tetrader vid ett senare tillfälle, om så önskas. </li&gt; </ol> 3. Sporbildande bibliotek av transformerade celler Skaffa Barcoded Tetrads <ol><li> Återuppliva celler från frusna förråd skapats i 2,3 av O / N tillväxt i 5 ml YPD + G418 (200 | ig / ml) vid 30 ° C med omröring. </li><li> Tvätta cellerna från O / N kulturerna 3 gånger i PBS (pH 7,4) och därefter återsuspendera cellerna i sporbildning mediet 7 plus 200 | ig / ml G418. </li><li> Skaka sporbildningen kulturer vid RT och övervaka sporuleringen framsteg dagligen fram nya tetrader har slutat formning. </li><li> När kulturen innehåller välformade tetrads och relativt få dyader, avlägsna kulturer från agitation och lämna vid rumstemperatur i minst 7 dagar. Medan vissa korsningar kan vara mottaglig för den platta matsmältning och störningar så snart tetrads har bildats (bedömt enligt beskrivningen i 7.3), är avgörande för andra korsar den ytterligare inkubation (7-10 dagar i våra experiment). Därför är detta steg rekommenderas starkt. </li></ol> 4. InrättaFACS Gates för Tetrad Sortering Den meiotiskt uttryckt SPS2-GFP fusion på pCL2_BC plasmiden tillåter tetrader i sporbildning kultur som skall detekteras och isoleras från odlingen genom fluorescens. Följande protokoll har utvecklats för en FACSAria II. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig2highres.jpg" width="500" /> Figur 2. FACS grindar. En serie av fyra sekventiella grindar används för att isolera tetrader. Grindarna som visas i (A) och (B) att minska antalet av klumpar. Fluorescerande händelser väljs med porten på (C). Histogrammet i (D) har två toppar. Händelser i den vänstra toppen är främst tetrads (vänster infälld bild), och händelser i den högra toppen är i allmänhet Tetrads med en bifogad knopp (höger infälld bild). En slutlig grind ärtillämpas på detta histogram för att välja händelser som oftast tetrads (röda staplar). Denna siffra har ändrats från Ludlow, et al 1. <ol><li> Ladda sporulerade kulturen på en FACS sorterare och ställa in två Forward Scatter och Side Scatter grindar för att utesluta skräp, hopklumpade celler, och flera celler per droppe (figur 2A och 2B). </li><li> Det bör finnas en population av fluorescerande celler, som vid användning av SPS2-GFP-reporterkonstruktionen innehåller dyader och tetrader 10. Gate GFP vs FSC att inkludera dessa fluorescerande händelser (figur 2C). </li><li> Beroende på belastningen bakgrund kan det vara nödvändigt att innefatta en ytterligare grind för att avlägsna klumpar som inkluderar tetrader och andra celler. Om detta är nödvändigt, inspektera en FSC-histogram av de fluorescerande händelser och ange en grind som innehåller händelser med lägre FSC (Figur 2D, gated händelser är i rött). </li><li> Kontrollera effektiviteten av t<html> Han slussning regim genom att sortera ~ 1.500 tetrader på ett objektglas och räkna andelen tetrader till icke-tetrads använder ett faskontrastmikroskop vid 400X förstoring. I procent av tetrads exakt kan uppskattas genom att räkna bara ~ 200 sorterade händelser, men sortering ~ 1500 minskar mängden tid åt till att söka efter celler på objektglas. Alternativt kan bedömas förhållandet tetrader till icke-tetrader under steg 4.5. </li><li> Kontrollera med jämna mellanrum att sorteraren är korrekt rapporterar antalet händelser genom att sortera 25 tetrader på ett objektglas och undersöka celler i droppen med hjälp av ett faskontrastmikroskop vid 400X förstoring. Det ska finnas 25 tetrader i droppen. Upprepa 3-4x för att bedöma variansen för FACS instrumentet. </li></ol> 5. Sortering Tetrads på en agarplatta p_upload/51401/51401fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figur 3. Placering av agarplattan på FACS-sorterare. Vill sortera tetrader in i en liten droppe av zymolyas lösning placerad i mitten av en standard (cirkulära) agarplatta, en standard (100 mm rektangulär) 96-brunnar är första placeras på stadium av cellsorterare och sorteraren är programmerad att deponera tetrader in i en specifik brunn (i detta fall D5). Därefter cirkulär agarplatta placeras ovanpå 96-brunnars platta och inriktad så att droppen av zymolyas är centrerad över den specificerade också. <ol><li> Värm det önskade antalet YPD + G418 (200 pg / ml)-plattor under minst 1,5 h i en 37 ° C inkubator placerad nära FACS-sorterare. </li><li> Ett viktigt inslag i sorteringsprotokollet är förmågan att korrekt rikta FACS sorteras tetrader till en viss plats på en agarplatta som innehåller en pool av zymolyas lösning. För att göra detta, placera en &quot;milstolpe&quot; 96-brunnar på than automatiserad cellavsättningsenhet (ACDU) hos sorteraren. Förbered en sorts layout som kommer att sortera 25 tetrader i en brunn på en 96-brunnsformat. Välj en väl nära mitten av plattan, t.ex. väl D5. Figur 3 visar en Petri-skål och platta med 96 brunnar satsades på en cellsorterare. Sortering 25 tetrader per platta ger väl separerade kolonier. </li><li> Ta med en stapel av 10 agarplattor från 37 ° C inkubator för att sorteraren. </li><li> Ta en agarplatta och pipett 25 ul av zymolyas lösning (1 mg / ml i 0,7 M sorbitol) på agar nära mitten av plattan. Sedan placera plattan på landmärke 96-brunnar, rikta in zymolyas droppen över målet väl från steg 5,2, t ex väl D5. </li><li> Starta sortera och sätta in 25 tetrader i mitten av zymolyas droppen på agarplatta. Ta sedan bort och täcka plattan. </li><li> Upprepa steg 5.4 och 5.5 fram till 25 tetrads har sorterats in i Zymolyase droppar på varje platta i stapeln. </li&gt; <li> Tillbaka bunten av tetrad-innehållande plattor till 37 ° C inkubator. </li><li> Upprepa steg 5.3 till 5.7 tills alla plattor har tetrads. </li></ol> 6. Separera Sporer <ol><li> Inkubera varje stapel av tetrad-innehållande agarplattor vid 37 ° C under 1,5 timmar. </li><li> Ta bort plattor från inkubatorn, lägga 15-25 steril 3 mm glaspärlor per platta, och skaka plattorna som en bunt (eller som två staplar med 5 plattor) i 3-5 min. Den bästa spor separation uppnås genom att flytta plattorna fast från sida till sida eller framifrån och bak. Flytta inte plattorna så att pärlorna &quot;virvel&quot; runt den yttre kanten av plattan. Lämna pärlorna på plåtarna när den är klar. </li><li> Placera plattstapeln med pärlor framsidan uppåt i en 30 ° C inkubator. Hämta nästa stack plattorna från 37 ° C inkubator, och upprepa steg 6.2. </li><li> Inkubera plattorna O / N vid 30 ° C. </li></ol> 7. Skörd kolonier <ol><li> Efteren O / N-inkubering vid 30 ° C bör små kolonier har bildats på plattorna. Ta försiktigt bort plattorna från inkubatorn utan att störa glaspärlor. </li><li> Ta bort glaspärlor genom att noggrant och snabbt vända plattorna över en djup behållare. Behållaren ska vara tillräckligt djup för att fånga kulorna utan att låta dem studsa upp och träffade agarplatta. Genom att peka på botten av plattan medan den är inverterad kan hjälpa rubba pärlor som är fastsatta på plattan. Dessa pärlor kan återanvändas genom noggrann tvättning med tvål och skölj väl med avjoniserat vatten och sterilisering genom autoklavering. </li><li> Räkna antalet kolonier på varje platta och använda antalet kolonier för att uppskatta effektiviteten i spor separation och utvinning. Till exempel kan 25 tetrader per platta för ett kors med nära 100% viabilitet ger totalt 100 kolonier per platta. </li><li> Från plattor med tillräckligt antal kolonier (&gt; 65 för en hög lönsamhet kors), överföra celler från varje coloarje till en separat brunn i en 96-brunnsplatta innehållande flytande YPD + G418. Också, anteckna vilka brunnar innehåller kolonier från samma agarplatta; denna information kommer att användas för att hjälpa tetrad uppdraget programvaran. </li><li> Använd 96-såväl flytande plattor till utsäde kulturer för genotypning och för att spara stammar som frysta glycerol lager. Uppgifter om RAD-tag-sekvensering och sekvensanalys kan hittas i Ludlow m.fl. 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Ludlow, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+tetrad+analysis.">High-throughput tetrad analysis.</a> Nat Methods. 10, 671-675 (2013).</li><li>Rose, M., Winston, F., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Yeast Genetics A Laboratory Course Manual. , (1990).</li><li>Morin, A., Moores, A. W., Sacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Saccharomyces+cerevisiae+asci.">Dissection of Saccharomyces cerevisiae asci.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li><li>Winge, O., Laustsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+two+types+of+spore+germination,+and+on+genetic+segregations+in+Saccharomyces+demonstrated+through+single+spore+cultures.">On two types of spore germination, and on genetic segregations in Saccharomyces demonstrated through single spore cultures.</a> C.R. Trav. Lab. Carlsberg Ser. Physiol. 24, 263-315 (1937).</li><li>Coluccio, A., Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspore+bridges:+a+new+feature+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+spore+wall.">Interspore bridges: a new feature of the Saccharomyces cerevisiae spore wall.</a> Microbiology. 150, 3189-3196 (2004).</li><li>Baird, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+SNP+discovery+and+genetic+mapping+using+sequenced+RAD+markers.">Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers.</a> PLoS One. 3, (2008).</li><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants.">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5791-57 (1991).</li><li>Gerke, J. P., Chen, C. T., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+isolates+of+Saccharomyces+cerevisiae+display+complex+genetic+variation+in+sporulation+efficiency.">Natural isolates of Saccharomyces cerevisiae display complex genetic variation in sporulation efficiency.</a> Genetics. 174, 985-997 (2006).</li><li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. L., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross.">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494, 234-237 (2013).</li><li>Fogel, S., Mortimer, R., Lusnak, K., Tavares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+gene+conversion:+a+signal+of+the+basic+recombination+event+in+yeast.">Meiotic gene conversion: a signal of the basic recombination event in yeast.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 2, 1325-1341 (1979).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Många områden av genetisk forskning, allt från komplexa drag kartläggning 11 till studier av mekanismerna bakom DNA-rekombination 12, kräver extremt stora antal avkomma och höga volymer av DNA-sekvensering. Tekniker som gifta sig kraften i konventionella inflygningar med kapacitet för hög genomströmning DNA-sekvensering har potential att möjliggöra studier som tidigare svårlösta. Trots att flera hög kapacitet jäst genetik metoder har tillämpats på ett effektivt sätt på specifika problem, har var och begränsningar som inte når upp till den breda tillämpningen av konventionell tetradanalys. BÄSTA adresser dessa utmaningar genom att anställa en hög genomströmning strategi som kombinerar tetrad dissekering och genotypning avkomman av jäst kors. I samband med multiplex RAD-tag-sekvensering, erbjuder BEST ett billigt sätt att få fram genotyp information för varje avkomma stam samtidigt tetrad relationer med hjälp av unika tetrad streckkoder.0; Av alla närvarande används hög genomströmning metoder, BÄST närmast rekapitulerar den information som ett manuellt dissekeras jäst kors. BEST har två viktiga funktioner. Den första är användningen av FACS för att snabbt isolera tetrads ifrån unsporulated celler i kultur (protokollsteg 5-6). Förmågan att isolera tusentals fluorescerande händelser (tetrads) ger BEST sin största vinst i genomströmning. Denna automatisering ger en ännu större fördel jämfört med manuell dissektion för korsningar med låg sporulering effektivitet, beroende på den ökade tid som krävs för att visuellt identifiera sällsynta händelser. Den andra viktiga funktionen är att använda en mycket komplex molekylär streckkod (Protocol Steg 2) som överförs till varje syster sporer av en tetrad. Eftersom dessa streckkoder kan användas för att beräkningsmässigt rekonstruera tetrad relationer mellan sporer som har slumpmässigt fördelade över en agarplatta, behovet av att manuellt matrisceller i ett beställt rutnät lindras. Slutligeneftersom den molekylära streckkoden och sporulering specifika GFP-reportergenen är fysiskt kopplade (på samma plasmid) används endast tetrader som har behållit den molekylära streckkod väljs genom FACS-sortering. Det finns två faktorer som styr den tid som kulturer bör inkuberas vid sporulering mediet. För det första, eftersom sporbildningen specifika reportern (SPS2-GFP) uttrycks tidigt i meios, GFP ensamt skiljer inte kompletta 4-spor tetrader från celler som inte har avslutat meios (dvs. dyader). Medan ytterligare FACS slussning kan minska antalet fluorescerande, ofullständiga tetrader, är det enklaste sättet att minska dessa oönskade händelser helt enkelt övervaka sporuleringen kulturen (Steg 3.3) och fortsätter gång nya tetrader har slutat formning. I våra experiment, är frekvensen hos dyader sorterat mindre än 1%. För det andra, för vissa korsningar extra tid i sporulering medium vid rumstemperatur utan omrörning (Steg 3.4) SIGligt förbättrar separationen av tetrader av glaspärlor under plätering ((Protokoll steg 6). Faktum är absolut nödvändigt för att störningar i en del korsningar detta steg. Liksom alla höga genomströmning metoder är BÄST &quot;bullrigare&quot; än motsvarande konventionella sättet. Den blygsamma minskning av effektiviteten i BEST jämfört med konventionell tetrad dissektion kan leda till kombinationer av flera faktorer. En faktor är den ökade förlusten av annars livskraftiga sporer, vilket kan leda till vidhäftning till glaspärlor under spridning eller ökad spor död på grund av de mekaniska påfrestningar i processen. En annan faktor kan vara enkelt plasmidförlust under meios. En tredje faktor kan vara en effektiv minskning av användbara kolonier till följd av kolonier med blandade genotyper, korsar en uppskattad ~ 5% av kolonier i vår pilot 1. Det är troligt att dessa kolonier representerar misslyckanden syster spore separation. Eftersom den snabba fluorescence sortering och spor separation medger insamling av enorma mängder tetrads är BÄST väl rustad för att övervinna minskar i effektivitet på denna skala. Även framtida upprepningar av BEST kunde öka effektiviteten närmar sig manuell dissektion är det kanske mer troligt att den nuvarande exponentiella banan för DNA-sekvensekapacitet snabbt kommer att kompensera för denna nivå av användbara stam förlust. Oavsett, kommer förmågan att utföra tetradanalys på skalan att som bäst kan användas för undersökningar som för närvarande är omöjligt med manuella metoder.

Meiotisk gen kartläggning, allmänt känd som tetradanalys, är centralt för jästgenetik. I korthet är två haploida stammar, var och en innehåller en enda kopia av varje kromosom, parad för att bilda en heterozygot diploida stammen med två kopior av varje kromosom, en från varje förälder. Svältande diploida celler för kväve inducerar meios (sporulering) där kromosomerna duplicera, genomgår ombildning, och dela i fyra haploida celler (sporer eller segreganter) med nya kombinationer av alleler från varje förälder. De fyra sporerna till följd av en enda meios kan isoleras genom en manuell process som kallas tetrad dissekering. Konventionell tetrad dissektion 2,3 som har förändrats relativt lite sedan den ursprungliga publiceringen 1937 4, har tre mål. Först måste celler som har genomgått meios (tetrads) isoleras från en bakgrund av vegetativa celler. I konventionell analys, åstadkommes detta genom en forskare som, med hjälp avett mikroskop identifierar visuellt tetrader på en agarplatta och sysselsätter en mikromanipulator anordning visuellt identifiera tetrader på en agarplatta och med användning av en mikromanipulator för att förflytta tetrad till ett cellfritt område av plattan. Därefter måste de fyra sporer i tetrad fysiskt åtskilda för att förhindra interspore parning. Sporer inom en tetrad hålls samman med både en ascus, återstoden av cellväggen hos den ursprungliga diploid cell, och en uppsättning av interspore bryggor 5. Vid konventionell tetrad analysen ascus avlägsnas genom enzymatisk nedbrytning, och en forskare använder mikromanipulator att bryta interspore broar och retas isär sporerna. Slutligen är de individuella sporer anordnade i en inrutade mönster som bibehåller förhållandet mellan de sporer, dvs all avkomma i en rad av fyra är syster sporer av samma original tetrad. En erfaren jäst forskare kan slutföra processen med att dissekera 10 tetrads (en allmänt accepterad lägsta antalper kors) i ca 15 min. Vi har utvecklat en ny hög genomströmning tetrad genotypning metod, som vi kallar B arcode E nabled S equencing av T etrads (BEST) 1. BEST utvecklar vidare dagens metoder i hög genomströmning genetik genom att möjliggöra generering och genotypning av stora antal avkomma som är isolerade, genotypade, och underhålls som individer på ett sätt som gör att syster spor relationer av alla fyra meiotiska produkter som skall återvinnas. Detta sker med hjälp av tre huvudstrategier (Figur 1). Först är införandet av en reporterkonstruktion som märker celler som har genomgått meios med GFP och gör att de kan isoleras genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). För det andra är införlivandet av en mycket komplex DNA-streckkod (en sträng av 15 slumpmässiga nukleotider) i en form som överförs till alla fyra sporer av en tetrad och kan läsas av DNA-sekvensering av rekombinanta Progeny och därmed identifierar syster sporer från samma tetrad. Tredje är genotypning steget, och BEST är kompatibel med många plattformar som fångar både en uppsättning av genetiska markörer samt tetrad specifika streckkod genotypning. Vi använder ett restriktionsställe-associerade DNA-taggen sekvensering (RAD-punkter) 6 metod som styr genomsekvense till specifika restriktionsställen 1 och därigenom ta ett konsekvent 2-3% av genomet hos avkomman stammar liksom plasmidburna streckkod . Återhämtningen av tetrad relationer tillsammans med den empiriskt härledda genotypning uppgifter från korset gör det korrekt slutsats av information som saknas, inklusive status markörer med låg sekvenstäckning och den fullständiga genotypen av inviable (och därmed omöjlig) individer. Här beskriver vi tillämpningen av metoden i den vanligast använda mikroorganism för meiotisk kartering, jästen S. cerevisiae. Men med mindre substitutioner av organism-specifika reaherrar, t.ex. olika sporulering specifika proteiner smält till GFP, bör metoden vara lätt överföras till andra mikroorganismer, inklusive organismer i vilka meiotisk kartläggning är betydligt mer arbetsintensiv eller närvarande svårlösta. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" width="400" /> Figur 1. Bästa metoden. (A) Den pCL2_BC plasmiden är en 2-mikron plasmid med en sporulering specifik GFP fusion, resistens mot G418, samt en 15-mer slumpmässig streckkod. Konstruktion av plasmiden biblioteket beskrivs i Ludlow m fl 1. (B) En pool av streckkodade plasmider transformeras in i den diploida stammen från ett kors. (C) Trans odlas sedan på urval och ~ 10.000 omvandlade kolonier samman och sporulerades. Under meios varje spor av en tetrad ärver en copy av streckkods plasmiden. (D) Tetrads separeras från unsporulated celler genom FACS och samlas på agarplattor, där de bryts ner och störs för att varje spor för att bilda en koloni. (E) Kolonier plockas sedan in i 96-brunnsplattor, phenotyped och genotypas. Under genotypning plasmiden streckkod läses och används för att identifiera de fyra medlemmarna i varje tetrad. Denna siffra har ändrats från Ludlow m fl 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51401/51401fig1highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">FACSAria II (Special order unit)</td>
			<td style="width:149px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">-</td>
			<td style="width:155px;">Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td colspan="2">643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolyase 100T</td>
			<td>Seikagaku Biobusiness</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418</td>
			<td>A.G. Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

best: barcode enabled sequencing of tetrads

Tetradanalys är ett värdefullt verktyg för jäst genetik, men det mödosamma manuella karaktären i processen har hindrat dess tillämpning på stora skalor. Barcode Enabled sekvensering av Tetrads (BEST) 1 ersätter manuella processer för att isolera, störa och avstånd tetrads. BEST isolat tetrader i kraft av en sporulering specifika GFP fusionsprotein som tillåter fluorescensaktiverad cellsortering tetrader direkt på agarplattor där ascus enzymatiskt spjälkade och sporerna störs och slumpvis ordning av glaspärla plätering. De haploida kolonierna delas sedan syster spor relationer, det vill säga uppgifter om vilka sporer härstammar från samma tetrad, med hjälp av molekylära streckkoder läses under genotypning. Genom att ta bort flaskhalsen för manuell dissektion, kan hundratals eller tusentals tetrads isoleras på några minuter. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av de experimentella procedurer som krävs för att utföra BÄST i jästenSaccharomyces cerevisiae, som börjar med en heterozygot diploid stam genom isolering av kolonier härledda från den haploida meiotiska avkomma.

BÄSTA kan avsevärt förbättra hastigheten med vilken sporer från tetrads kan isoleras. Som ett exempel på den genomströmning denna metod kan leverera, utförs en forskare FACS sortering och spor separation (steg 5,1 till 6,3) med 149 agarplattor i 3 tim 1. En motsvarande avkastning (cirka 3.725 tetrads) skulle kräva mer än 90 timmar av manuell dissektion. Men som med många high throughput metoder har den nuvarande iterationen av förfarandet en viss förlust av effektivitet jämfört med manuell dissektion. Denna förlust visar sig som ett minskat antal kolonier återvunna jämfört med förväntningarna beräknas baserat på spor livskraft korset, bestäms genom manuell dissektion (steg 1,4). Förutsatt att orsakerna till spor förlust (Diskussion) påverkar sporer slumpmässigt, kan uppskattningar göras av hur många återvunna kolonier kommer att ingå i tetrader där 1, 2, 3, eller 4 sporer har återvunnits (Figur 4). Figur 4. Simulering av metod verkningsgrad på tetrad nivå. Att inte lyckas återvinna sporer (som kolonier) kan bero på spor inviability, spor vidhäftning till glaspärlor, underlåtenhet att skilja sporer från varandra, etc. Binomialfördelning användes för att beräkna den förväntade andelen tetrads (med minst ett framgångsrikt återhämtat spor) producerar 4, 3, 2 eller 1 kolonier som bygger på den andel av alla sporer framgångsrikt återvunnits. Detta diagram kan tjäna som en grov uppskattning av antalet stammar som i slutändan kommer att monteras in i 3 - eller 4 - spor tetrads. Eftersom antalet kolonier per platta ökar, så ökar antalet hela tetrader återvunnits. I beskrivna experimentet ovan, 25 tetrader från ett kors med spor livskraft nära 100% (som DETermined genom manuell dissektion) 1 ströks ut på 149 agarplattor. I detta experiment, det maximala antalet kolonier observerade per platta var 80, vilket indikerar att 20 sporer misslyckades att bilda diskreta kolonier. Det genomsnittliga antalet kolonier per platta var 62. Kolonier från de 61 plattor innehållande 65 kolonier eller fler skördades och sekvens. Av de 3700 stammarna som passerade sekvense kvalitetskontroll, kunde 72% vara beräkningsmässigt tilldelade i 3 - eller 4 - spore tetrader.

Watch this Scientific Journal Video about BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads at JoVE.com

BEST: Barcode Enabled Sequencing of Tetrads

Barcode Enabled sekvensering av Tetrads (BEST) ersätter manuella processer för att isolera, störa och avstånd tetrads. BEST isolat tetrader genom fluorescensaktiverad cellsortering på agarplattor, separerar sporerna genom omrörning med glaspärlor, och bestämmer som är slumpvis anordnade kolonier härledda från samma ursprungliga tetrad med molekylära streckkoder.

BÄST: Barcode Enabled sekvensering av Tetrads

Tetrad analysis is a valuable tool for yeast genetics, but the laborious manual nature of the process has hindered its application on large scales. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Konkurrenskraftiga Genomic skärmar av streckkodade Jäst bibliotek

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Detektering av sällsynta genomiska varianter från poolad sekvensering med SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Nästa generations sekvensering av 16S ribosom RNA Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Riktade DNA-metylering analys av Nästa generations sekvense

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' slutet sekvensering bibliotek förberedelser med A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering av 3D vit fettvävnad struktur med hjälp av hela-mount färgning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Assessment of the Metabolic Effects of Isocaloric 2:1 Intermittent Fasting in Mice

Bedömning av de metaboliska effekterna av Isokalori 2:1 intermittent fasta hos möss

Intermittent fasting (IF), a dietary intervention involving periodic energy restriction, has been considered to provide numerous benefits and counteract ...