Name: efficient generation human induced pluripotent stem cells from human somatic cells with sendai-virus
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00
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私たちは、原稿上で貴重な議論のためにイ·ラボのメンバーに感謝したいと思います。李研究室での作業は、細胞研究基金（TEDCO）を幹ニューヨーク幹細胞財団のロバートソン研究者賞からメリーランド州からの補助金によって支えられている。

1。細胞の作製とメディア（1日目） <ol><li>文化DMEM培地を10％FBSを含むヒト線維芽細胞を展開します。 </li><li>形質導入の前日に、ウェル当たり、適切な密度で24穴プレートにプレートヒト線維芽細胞（ 図1）。 注：異なる種類の細胞が別の添付ファイルの能力を持っているので、次の段階希釈は（200K、100K、50K、25K、12.5Kと6.25K）をお勧めします。 </li><li>細胞が?...

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors.">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon.">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA.">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation,+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures.">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .</li><li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells.">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li></ol>

hiPSCsにヒト体細胞を再プログラミングすることは、基本的な生物学、個人的な医学、移植12で前例のない約束を保持している。このような薬剤の開発および移植治療13などのさらなる臨床応用を制限する望ましくない遺伝子変異を作成することができ、宿主ゲノムへと統合リスクが以前に、人間のIPSC世代に必要なDNAウイルス。このような理由で、多くの研究は、いくつかの代...

ヒト胚性幹細胞（hESC）は、自己再生をインビトロで多能性を有し、薬物スクリーニング、疾患のモデリングのための潜在的に有用である可能性があり、疾患および組織傷害を治療するための細胞ベースの治療法を開発するための能力を有する。しかし、ヒトES細胞が原因、免疫学、腫瘍学、倫理的な障壁の細胞置換療法には限界があり、病気に関連する遺伝子を研究するために、疾患特異的ヒトES細胞は、着床前遺伝子診断（PGD）アプローチによって単離することができたが、それはまだ技術的に困難であるおよび胚の寄付はかなり稀である。これらの問題は、誘導多能性幹細胞（hiPSCs）の開発につながっている幹細胞生物学の進歩に関連している。 人間性IPSCは、遺伝的にヒト成人の体細胞から再プログラムし、それらには、Dなどの再生医療のための有用な供給源となるヒトES細胞に類似した多能性幹細胞のような特性を抱いている患者固有の方法1,2での敷物の発見、病気のモデリングと細胞療法。 今まで、ウイルス媒介（レトロウイルスおよびアデノウイルス）を含むヒトiPS細胞を生成するためのいくつかの方法、3、非ウイルス媒介（BAC系およびベクターのトランスフェクション）4遺伝子形質導入、およびタンパク質送達システム5-7が存在する。 ウイルス媒介性遺伝子の送達効率をある程度確保することができるが、それらは制御されない様式で初期化遺伝子を発現するために宿主染色体に統合するので、ウイルスベクターは、遺伝的フットプリントを残すことができる。転写因子のウイルス組込みは、宿主遺伝子を活性化する8又は不活性化することができる場合であっても、予想外の遺伝子異常5,9および腫瘍形成のリスクを引き起こす可能性がある。一方、体細胞へのタンパク質又はRNAの直接的な導入が報告されているが、このような労働集約的な繰り返し変圧などのいくつかの欠点を有したECTION、および7,10の再プログラミングの低レベル。偶数エピソームおよび非組み込み型アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびプラスミドベクターは、依然として比較的効率的である11。これらの理由から、IPSCの発生の高い有効性と少ない遺伝子異常を持つ非統合書き換え方法を選択することが妥当である。本研究では、仙台ウイルスベースのプログラミングを使用しています。この方法は、宿主ゲノムに統合されていないと一貫して導入遺伝子の統合なしにヒトiPS細胞を産生することが知られている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">CytoTune-iPS Reprogramming Kit</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1378002</td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated&#160;</td>
			<td>Global stem</td>
			<td>GSC-6105M&#160;</td>
			<td>5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:195px;">&#160;invitrogen</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td>353935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Y-27632</td>
			<td style="width:195px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:119px;">1254</td>
			<td>10 uM (Stock: 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES&#160;</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>10 ng (Stock : 100 ug)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Knock-out serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)</td>
			<td style="width:195px;">&#160;invitrogen</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine-200 mM (100X), liquid</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td>21985023</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hausser Phase Contrast Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">SSEA-4</td>
			<td style="width:195px;">DSHB</td>
			<td>MC-813-70</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tra-1-81</td>
			<td style="width:195px;">cell signaling</td>
			<td>4745S</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal Oct4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5279</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Nanog</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1997</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Alexa Flouor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>948492</td>
			<td>1/2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td style="width:195px;">cellgro</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td>205313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">PCR Master Mix [2X]</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">K0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">picking hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NU-301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">dissecting scope&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation human induced pluripotent stem cells from human somatic cells with sendai-virus

数年前、人間の人工多能性幹細胞（iPS細胞）の設立は、生物医学の新時代が幕を開けた。ヒトiPS細胞の潜在的な使用は、ヒト遺伝性疾患の病因モデリング、遺伝子修正後の自己細胞療法、および患者特有の症状と関連する細胞の供給源を提供することによってパーソナライズされた薬剤スクリーニングが挙げられる。しかしながら、このようなヒトiPS細胞の製造後に残留する初期化因子の導入遺伝子発現を排除するような克服するため、いくつかのハードルが存在する。さらに重要なことは、未分化ヒトiPS細胞の残留導入遺伝子の発現は、適切な分化を阻害し、in vitroの表現型における疾患関連の解釈を誤った方向へ導くことができます。このような理由で、統合のない、および/または導入遺伝子のない人間性IPSCは、アデノウイルスは、piggyBacシステム、ミニサークルベクター、エピソームベクター、直接のタンパク質送達と合成されたmRNAのようないくつかの方法を使用して開発されている。しかし、reprograの効率統合のない方法を用いてmmingは、ほとんどの場合、非常に低い。 ここでは、センダイウイルス（RNAウイルス）ベースの再プログラミングシステムを用いてヒトiPS細胞を単離するための方法を提示する。この初期化方法は、費用対効果の高い方法で一貫した結果、高効率を示している。

通常感染した線維芽細胞は、センダイウイルス形質導入後数日内のいずれかの形態学的変化を示していないが、5日後に、それらは異なる形状（ 図1）を有することを開始します。 図1の右側のパネルで説明したように、細胞は、任意のより典型的な繊維芽細胞の形態を有していない。彼らは、細胞質よりも丸みを帯びた形状と大きな核を持っている。伝達は80％の細?...

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ここでは、一貫性のある成果と効率向上を示しているセンダイウイルスと導入遺伝子のない人間性IPSCにヒト体細胞を再プログラムする当社の確立された手法を提案する。

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Research

JoVE Journal

Biology

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Generation of Human CD40-activated B cells

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ヒトCD40活性化B細胞の生成

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

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In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

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Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

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小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

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大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells IPSCs Using Retroviral Vector with GFP Video (Video) | JoVE

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Video (Video) | JoVE

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generating Mice from Induced Pluripotent Stem Cells | Protocol (Video) | JoVE

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generating Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Uing the STEMCCA Lentiviral Vector | Protocol (Video) | JoVE

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format Video (Video) | JoVE

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...