Name: profiling individual human embryonic stem cells by quantitative rt-pcr
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00
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हम पांडुलिपि पर बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए ली प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. ली प्रयोगशाला में काम सेल रिसर्च फंड (TEDCO) स्टेम न्यूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन की रॉबर्टसन अन्वेषक पुरस्कार से और मेरीलैंड से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

एक 96 अच्छी तरह से थाली के 1. तैयारी <ol><li> 9 μl सिंगल सेल lysis समाधान एकल कक्ष DNase1 की 1 μl मिलाएं. </li><li> 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट की हर अच्छी तरह से में 10 μl मिश्रित समाधान रखो. </li></ol> FACS शोधन के लिए 2. Detaching hESCs <ol><li> मानव...

<ol>
	<li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog.">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li><li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state.">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li><li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells.">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li><li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment.">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li><li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells.">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li><li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li><li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+template+switching:+A+SMART+(TM)+approach+for+full-length+cDNA+library+construction.">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li><li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells.">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li><li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li></ol>

सिंगल सेल जीन रूपरेखा एक एकल कक्ष की कार्यक्षमता या एक पूरी आबादी की भविष्यवाणी करने के लिए एक प्रमुख साधन हो सकता है. कारण तकनीकी सीमा तक, पूरे जीन रूपरेखा विश्लेषण आबादी के औसत के लिए प्रतिबंधित कर दि?...

अधिकांश उच्च यूकेरियोट आबादी जमा आबादी के विश्लेषण के साथ इस प्रकार विषम रहे हैं, यह उनके सेलुलर सुविधाओं की व्याख्या करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है. आबादी के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं आसानी से अलग किया जा सकता है, और इन मतभेदों को पूरी आबादी 1, 2 की संपत्ति और समारोह के लिए महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं. विशेष रूप से, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) नाजुक विशिष्ट तरीके 3, 4 में वंश विनिर्देश के pluripotency के विभिन्न स्तरों और विविध क्षमता का कारण बनता है, जो विषम हो जाना जाता है. उदाहरण के लिए, विभिन्न कोशिका की सतह एंटीजन undifferentiated pluripotent स्टेम कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 5 और ऑस्टिन स्मिथ समूह उनकी आकृति विज्ञान, भेदभाव प्रवृत्ति और मार्ग 6 सिगनल की निर्भरता पर आधारित, माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में pluripotency के विभिन्न स्तरों का प्रस्ताव रखा. यह घटना मानव भ्रूण में धारणा थीएनआईसी स्टेम कोशिकाओं 7. समग्र पढ़ाई अलग स्टेम सेल लाइनों, न कि व्यक्तिगत एकल स्टेम कोशिकाओं के बीच प्रदर्शन किया गया है, जबकि यह संभवतः सभी दैहिक सेल प्रजातियों की ओर उनके भेदभाव क्षमता को प्रभावित करता है जो एकल कोशिका के स्तर पर pluripotency के विभिन्न स्तरों का विश्लेषण करने के लिए बहुत पेचीदा हो सकता है. सेलुलर और आणविक विविधता &#39;एकल कक्ष transcriptome&#39; कहा जाता है, जो प्रतिलेखन रूपरेखा तय करती है और जीन अभिव्यक्ति के स्तर 8-10 बढ़ाता के लिए नए तरीकों पर जोर दिया जा सकता है. व्यक्ति की कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के स्तर के विश्लेषण के लिए, हम एकल कक्ष मात्रात्मक RT-पीसीआर की एक सरल, लेकिन मजबूत प्रोटोकॉल विकसित की है. हम कम से कम तकनीकी विविधताओं और मतभेद में जिसके परिणामस्वरूप, प्रत्येक एकल कक्ष lysates के आधे के साथ ही hESCs के क्रमानुसार पतला कुल RNAs तुलना करके हमारे प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता और व्यवहार्यता की पुष्टि की. इसके अलावा, हम समरूप पी अलग करने के लिए एक आनुवंशिक संवाददाता लाइन का इस्तेमाल कियाजीन लक्ष्यीकरण प्रणाली का उपयोग hESCs के opulation. Oct4 ठिकाना (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro निर्माण) और talen plasmids के एक जोड़ी को निशाना बनाने के लिए दाता वेक्टर 11 इस्तेमाल किया गया. दाता वेक्टर और talen plasmids के एक जोड़ी हमारे nucleofection और प्रतिरूप चयन प्रोटोकॉल और hESCs हमारी दिनचर्या प्रोटोकॉल 12 के आधार पर प्रदर्शन किया गया था के रखरखाव का उपयोग hESCs (H9, WA09) में शुरू किए गए थे. हम इस आनुवंशिक संवाददाता लाइन Oct4 में oct4 अभिव्यक्ति के लिए EGFP व्यक्त :: EGFP hESCs की पुष्टि की. हमारे परिणाम (Oct4 के अनुसार क्रमबद्ध :: EGFP दृढ़ता से सकारात्मक कोशिकाओं) व्यक्तिगत hESCs Oct4 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर पर है, लेकिन Nanog अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों कि पकड़ को दर्शाता है. तो, हमारी एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति परख pluripotent स्टेम सेल की आबादी विषमताओं के अध्ययन करने के लिए उपयोगी होना चाहिए.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="807">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">96 wll PCR Plate</td>
			<td style="width:123px;">USA scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-8900</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Ambion Cell Lysis Kit</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SMARTScribe Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:123px;">Clonetech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">639536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ExoSAP-IT</td>
			<td style="width:123px;">USB</td>
			<td align="right" style="width:119px;">78200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mM dNTP Mix, PCR Grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SYBR Universal 2X Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Kapa biosystem</td>
			<td style="width:119px;">KR0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>S-1100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling individual human embryonic stem cells by quantitative rt-pcr

स्टेम सेल जनसंख्या की विविधता ऐसी विभिन्न प्रजातियों की ओर उनके भेदभाव प्रवृत्ति के रूप में, स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के विस्तृत समझ बाधित. एक एकल कक्ष transcriptome परख व्यक्तिगत परिवर्तन विदारक के लिए एक नया दृष्टिकोण हो सकता है. हम एकल कक्ष QRT-पीसीआर विधि विकसित की है, और इस विधि कई जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अच्छी तरह से काम करता है कि इस बात की पुष्टि की है. एकल कोशिका के स्तर में, Oct4 के अनुसार क्रमबद्ध प्रत्येक मानव भ्रूण स्टेम सेल, :: EGFP सकारात्मक कोशिकाओं, Oct4 में उच्च अभिव्यक्ति, लेकिन Nanog अभिव्यक्ति का एक अलग स्तर पर है. हमारे एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति परख आबादी विषमताओं पूछताछ के लिए उपयोगी होना चाहिए.

कुशल और मजबूत एकल कक्ष आरएनए प्रवर्धन HESCs के बीच transcriptional भिन्नता को कम करने के लिए, हम Oct4 इस्तेमाल किया :: FACS शुद्धि के लिए EGFP hESC क्लोन. एक 96 अच्छी तरह से थाली में oct4 :: EGFP सकारात्मक कोशिक?...

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Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

मात्रात्मक RT-पीसीआर से व्यक्ति मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की रूपरेखा

सिंगल सेल जीन अभिव्यक्ति परख स्टेम सेल विषमताओं को समझने के लिए आवश्यक है.

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) के प्रचार - प्रसार

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murine भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से hematopoietic स्टेम सेल की व्युत्पत्ति

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के Immunosurgery द्वारा व्युत्पत्ति

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में Mitochondrial परिसर गतिविधि के लिए जांच

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से chromatin immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो लेबल में

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

संस्कृति और मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Karyotyping के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के गुणसूत्र फैलाओ तैयारी

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को ठंड और विगलन

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के Oligodendrocyte व्यापारियों में भेदभाव

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...