Name: profiling individual human embryonic stem cells by quantitative rt-pcr
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR at JoVE.com

Vi vill tacka medlemmarna i Lees lab för värdefulla diskussioner om manuskriptet. Arbetet i Lee labbet har finansierats med bidrag från Robertson Investigator Award i New York Stem Cell Foundation och från Maryland Stem Cell Research Fund (TedCo).

1. Framställning av en 96-brunnars platta <ol><li> Blanda 1 l av Single Cell DNase1 till 9 l Single Cell Lysis Solution. </li><li> Sätt 10 | il blandade lösningen i varje brunn i 96-brunnars PCR-platta. </li></ol> 2. Demontering hESCs för FACS Rening <ol><li> Drag av Oct4 :: EGFP ES cellinje från 60 mm skål med en ml Accutase under 20 min, vid 37 ° C, vilket neutraliserades med human ES medier. </li><li> Förbered cellpopulationen i en ml FACS-buffert och justera cellen till e...

<ol>
	<li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog.">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li><li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state.">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li><li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells.">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li><li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment.">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li><li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells.">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li><li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li><li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+template+switching:+A+SMART+(TM)+approach+for+full-length+cDNA+library+construction.">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li><li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells.">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li><li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li></ol>

Enda cell genen profilering kan vara ett viktigt verktyg för att förutsäga funktionaliteten i en enda cell eller en hel befolkning. På grund av tekniska begränsningar, har hela gen profilanalys begränsats till medelvärden befolkningen. Variationer i genuttryck mönster och nivåer mellan enskilda celler och subpopulationer har föreslagits för att orsaka felaktig tolkning. Sådana olika cellulära aspekter finns i hESCs och deras heterogenitet orsakar subtilt annorlunda förmåga att bibehålla pluripotens och ?...

De flesta högre eukaryota populationer är heterogena således med analys av integrerade populationsdata, är det ofta svårt att tolka deras cellulära funktioner. Individuella celler i en population kan vara subtilt annorlunda, och dessa skillnader kan få betydande konsekvenser för fastigheten och funktionen av hela befolkningen 1, 2. Speciellt är mänskliga embryonala stamceller (hESCs) kända för att vara heterogent, vilket orsakar olika nivåer av pluripotens och olika potentialer för härstamning specifikation i fint distinkta sätt 3, 4. Exempelvis kan olika cellyteantigener användas för att kategorisera odifferentierade pluripotenta stamceller, 5 och Austin Smith gruppen föreslagit olika nivåer av pluripotens i mus embryonala stamceller, baserat på deras morfologi, differentiering benägenhet och beroendet av signalväg 6. Detta fenomen hypotes i mänskligt embryonic stamceller 7. De generella studier utfördes bland olika stamcellslinjer, inte enskilda enstaka stamceller, kan det vara mycket intressant att analysera olika nivåer av pluripotens på enskild cellnivå, som eventuellt påverkar deras differentieringskapacitet mot alla somatiska cellinjer. Cellulär och molekylär heterogenitet kan dikteras av transkriptionsprofilering, som kallas den &quot;enda cell transcriptome&quot; och betonar nya metoder för att kvantifiera genuttryck nivåer 8-10. För analys av genuttryck nivåer i enskilda celler, utvecklade vi en enkel, men robust protokoll för enskild cell kvantitativ RT-PCR. Vi bekräftade effektiviteten och genomförbarheten av våra protokoll genom att jämföra varje halva av enstaka cellysater samt serieutspädda total RNA av hESCs, vilket resulterar i minimala tekniska variationer och skillnader. Vidare använde vi en genetisk reporter linje att isolera homogen pBefolknings av hESCs hjälp av riktad genmodifiering systemet. Donator vektor för måls Oct4 lokus (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro konstruera) och ett par Talen plasmider användes 11. Donatorvektor och ett par talen plasmider infördes i hESCs (H9, WA09) med hjälp av vår nucleofection och klonurvalet protokoll och underhåll av hESCs utförts baserat på vår rutin protokoll 12. Vi bekräftade detta genetiska reporter linje uttrycker EGFP för Oct4 uttryck i Oct4 :: EGFP hESCs. Vårt resultat visar att enskilda hESCs (sorterade efter Oct4 :: EGFP starkt positiva celler) håller hög Oct4 uttryck, men olika nivåer av NANOG uttryck. Så ska vår enda cell genuttryck analys vara intressant att studera befolkningsheterogeniteter av pluripotenta stamceller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="807">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">96 wll PCR Plate</td>
			<td style="width:123px;">USA scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-8900</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Ambion Cell Lysis Kit</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SMARTScribe Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:123px;">Clonetech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">639536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ExoSAP-IT</td>
			<td style="width:123px;">USB</td>
			<td align="right" style="width:119px;">78200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mM dNTP Mix, PCR Grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SYBR Universal 2X Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Kapa biosystem</td>
			<td style="width:119px;">KR0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>S-1100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling individual human embryonic stem cells by quantitative rt-pcr

Heterogenitet av stamceller befolkningen försvårar detaljerad förståelse av stamcellsbiologi, såsom deras differentiering benägenhet mot olika härstamningar. En enstaka cell transkriptom-analys kan vara en ny metod för att dissekera individuell variation. Vi har utvecklat den enda cell QRT-PCR-metoden, och bekräftade att denna metod fungerar bra i flera genuttrycksprofilerna. I en enda cell nivå har varje mänskliga embryonala stamceller, sorterade efter Oct4 :: EGFP positiva celler, högt uttryck i Oct4, men en annan nivå av NANOG uttryck. Vår enda cell genuttryck analys bör vara användbart för att förhöra befolkningsheterogeniteter.

Effektiv och robust enda cell RNA-förstärkning För att minimera den transkription variationen bland hESCs, använde vi Oct4 :: EGFP hESC klon för FACS rening. Efter sortering Oct4 :: EGFP-positiva celler i en 96-brunnsplatta är varje cell lyserades i lysbuffert och omvandlades poly (A) + RNA till fullängds-cDNA med användning av SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT)-primer och förankring med SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) med hjälp av SMART mall byta te...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR at JoVE.com

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR

Enda cell genuttryck analys behövs för att förstå stamcellsheterogeniteter.

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Spridning av mänskliga embryonala stamceller (ES-celler)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Sökning efter Mitokondriell komplex aktivitet på mänskliga embryonala stamcellslinjer

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

In vitro-märkning av mänskliga embryonala stamceller för magnetisk resonanstomografi

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Kultur och underhåll av mänskliga embryonala stamcellslinjer

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Kromosomala Sprid Beredning av mänskliga embryonala stamceller för karyotypning

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Nedfrysning och upptining mänskliga embryonala stamcellslinjer

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...