Name: profiling individual human embryonic stem cells by quantitative rt-pcr
Uploaded: 2014-05-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR at JoVE.com

Biz el yazması değerli tartışmalar için Lee laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Lee laboratuarda çalışma Hücre Araştırma Fonu (Tedco) Kök New York Kök Hücre Vakfı Robertson Araştırmacı Ödülü ve Maryland hibe tarafından desteklenmiştir.

Bir 96-yuvalı plaka içinde 1. Hazırlanması <ol><li> 9 ul Tek Hücre Çözme Çözüm Tek Hücre DNase1 1 ul karıştırın. </li><li> 96 çukurlu PCR plakanın her çukuruna 10 ul karıştırılmış çözeltisi koyun. </li></ol> FACS Arıtma 2. Ayrılmakta HESC <ol><li> Insan ES ortam ile nötralize edildi, 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1 ml Accutase ile 60 mm tabak, ikinci Oct4 :: EGFP ES hücre hattı çıkarın. </li><li> FACS tampon 1 ml hücre popülasyonu hazırlayın v...

<ol>
	<li>Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+ground-state+pluripotency+by+allelic+regulation+of+Nanog.">Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog.</a> Nature. 483, 470-473 (2012).</li><li>Leitch, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+germ+cells+from+mice+and+rats+exhibit+properties+consistent+with+a+generic+pluripotent+ground+state.">Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state.</a> Development. 137, 2279-2287 (2010).</li><li>Ramskold, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+mRNA-Seq+from+single-cell+levels+of+RNA+and+individual+circulating+tumor+cells.">Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.</a> Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).</li><li>Stewart, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+isolation+of+hESCs+reveals+heterogeneity+within+the+pluripotent+stem+cell+compartment.">Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment.</a> Nat Methods. 3, 807-815 (2006).</li><li>O'Malley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+with+novel+cell-surface+markers+identifies+routes+to+iPS+cells.">High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells.</a> Nature. 499, 88-91 (2013).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5, 621-628 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).</li><li>Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+neural+crest+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).</li><li>Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcriptase+template+switching:+A+SMART+(TM)+approach+for+full-length+cDNA+library+construction.">Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction.</a> Biotechniques. 30, 892-897 (2001).</li><li>Pan, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+for+full-length+RNA+sequencing+for+low+quantities+of+cells+and+single+cells.">Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).</li><li>Tang, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li></ol>

Tek hücre gen profilleme tek bir hücrenin işlevini veya tüm nüfusu tahmin etmek için önemli bir araç olabilir. Nedeniyle teknik sınırlaması, bütün gen profili analizi nüfus ortalamasına sınırlı olmuştur. Gen ekspresyonu ve tek tek hücreler ile alt grupları arasında seviyelerindeki varyasyonlar yanlış yorumlanmasına yol açtığı önerilmiştir. Gibi çeşitli hücresel yönleri HESC bulunabilir ve bunların heterojenite pluripotensini ve kader şartname sürecini korumak için kurnazca farklı ...

En yüksek ökaryot nüfus toplanmış nüfus analizi dolayısıyla heterojen, onların hücresel özelliklerini yorumlamak zordur. Bir nüfus içinde, tek tek hücrelerin kurnazca farklı olabilir, ve bu farklılıklar tüm nüfusu 1, 2 özelliği ve fonksiyonu için önemli sonuçlar doğurabilir. Özellikle, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) hassas bir şekilde ayırt edici 3, 4 içinde soy spesifikasyonuna pluripotensin farklı düzeylerde ve çeşitli potansiyelleri neden olan, heterojen olduğu bilinmektedir. Örneğin, farklı hücre yüzeyi antijenleri farklılaşmamış pluripotent kök hücreleri sınıflandırmak için kullanılabilir, 5 ve Austin Smith grup, morfoloji, farklılaşma yolu eğilimi ve 6 sinyal bağımlı bir göre, fare embriyonik kök hücreleri pluripotensin farklı düzeylerde önerdi. Bu olgu insan embriyosunda hipotezinic kök hücreler 7. Genel çalışmalar, farklı kök hücre hatları, bireysel değil tek bir kök hücreler arasında tülürken, potansiyel tüm somatik hücre soylarının doğru onların farklılaşma kapasitelerini etkileyen tek hücre düzeyinde pluripotensin farklı düzeylerde analiz etmek çok ilginç olabilir. Hücresel ve moleküler heterojenite &#39;tek hücreli transcriptome&#39; denir, transkripsiyon profilleme tarafından dikte ve gen ekspresyon düzeyleri 8-10 ölçülmesi için yeni yaklaşımlar vurguluyor olabilir. Tek tek hücrelerin gen ekspresyonu seviyesini ölçmek için, tek bir hücre nicel RT-PCR, basit, ancak güçlü bir protokol geliştirilmiştir. Bu asgari teknik varyasyonlar ve farklar ile sonuçlanan, her bir hücre lizatlarının yarısı gibi hESC seri olarak seyreltildi, toplam RNA karşılaştırarak eden protokol etkinliğini ve uygulanabilirliğini doğruladı. Ayrıca, biz homojen p izole etmek için genetik bir muhabir hattı kullanılırGen hedefleme sistemi kullanılarak hESC opulation. Oct4 lokusunu (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro yapı) ve TALEN plasmidlerin bir çift hedeflenmesi için verici vektör 11 kullanılmıştır. Donör vektör ve TALEN plasmitler bir çift bizim nucleofection ve klonal seleksiyon protokol ve HESC bizim rutin protokolüne 12 dayanılarak yapılmıştır bakım kullanılarak hESC (H9, WA09) girmiştir. Biz bu genetik muhabir hat Oct4 içinde Oct4 ifade EGFP ifade :: EGFP hESC doğruladı. Bizim sonuç (Oct4 olanlar :: EGFP kuvvetli pozitif hücreler) bireysel HESC Oct4 ifade yüksek düzeyde, ama Nanog ifade farklı düzeylerde sahip olduğunu göstermektedir. Yani, bizim tek bir hücre gen ekspresyon tahlil pluripotent kök hücrelerin nüfus heterojenliklerin incelemek yararlı olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="807">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">96 wll PCR Plate</td>
			<td style="width:123px;">USA scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-8900</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Ambion Cell Lysis Kit</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4458235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SMARTScribe Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:123px;">Clonetech</td>
			<td align="right" style="width:119px;">639536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ExoSAP-IT</td>
			<td style="width:123px;">USB</td>
			<td align="right" style="width:119px;">78200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">10mM dNTP Mix, PCR Grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">SYBR Universal 2X Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Kapa biosystem</td>
			<td style="width:119px;">KR0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Tech</td>
			<td>S-1100-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">FACS buffer</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">35 &#956;m cell strainer cap tubes</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling individual human embryonic stem cells by quantitative rt-pcr

Kök hücre nüfusun heterojenliği gibi farklı soy doğru onların farklılaşma eğilimi gibi, kök hücre biyolojisi ayrıntılı bir anlayış engellemektedir. Tek bir hücre transcriptome tahlil bireysel farklılık diseksiyon için yeni bir yaklaşım olabilir. Biz tek hücre Mah-PCR yöntemi geliştirdi ve bu yöntem, birkaç gen ekspresyon profilleri iyi çalıştığını doğruladı. Tek hücre düzeyinde, Oct4 olanlar her insan embriyonik kök hücre, :: EGFP pozitif hücreler, Oct4 yüksek ifade, ama Nanog bir ifade farklı bir düzeye sahiptir. Bizim tek bir hücre gen ekspresyon tahlil nüfus heterojenliklerin sorgulamak için yararlıdır olmalıdır.

Verimli ve güvenilir bir hücre RNA amplifikasyonu HESC arasında kopyalanma değişimini en aza indirmek için, kullanılan :: Oct4 FACS arıtma için EGFP HESC klonu. 96 oyuklu bir plaka içerisine Oct4 :: EGFP pozitif hücreler sıralama sonra, her bir hücre parçalama tamponu içinde lize edildi ve SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primeri kullanılarak ve SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ile sabitleme tam uzunlukta cDNA&#39;ya poli (A) + RNA dön...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR at JoVE.com

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Manyetik Rezonans Görüntüleme için in vitro Etiketleme

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...