Name: human neutrophil flow chamber adhesion assay
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
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この作品は、ループス研究所（ニューヨーク州ニューヨーク）、NIH P01-AR49084、NIH R21〜DA026956およびNIH UL1-TR00165が主催しています。我々は彼の継続的な支援のためにロバートP.キンバリーに感謝します。

この研究のために募集され、すべてのドナーが書面によるインフォームドコンセントを与え、研究はバーミンガム治験審査委員会のアラバマ大学によって承認された。 1。HUVEC最初の培養およびサブカルチャー<ol><li>内皮細胞基本培地から構成される完全増殖培地中、インビトロでの培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、内皮細胞増殖因子を補充した（材料のリストを参照）。 注：この研究で使用した増殖因子には：5 ng / mlのヒト組換え上皮成長因子（hEGFは）、1.0 mg / mlのヒドロコルチゾン、50 mg / mlのゲンタマイシンおよび50 ng / mlのアムホテリシン-B（GA-1000）、2 ％ウシ胎児血清（FBS）、0.5 ng / mlの血管内皮増殖因子（VEGF）、10 ng / mlのヒト線維芽細胞増殖因子-基本ヘパリン（のhFGF-B）、20 ng / mlのヒト組換えインスリン様成長因子を有する（ R 3-IGF-1）、1μg/ mlのアスコルビン酸、および22.5μg/ mlのヘパリン。完全培地37℃で最初に調製し、次いで製剤の1カ月以内に使用するために4℃で保存することができる。 </li><li>細胞のためのフラスコを調製するために、完全増殖培地を、75cm 2の組織培養フラスコ（1ミリリットル/ 5cm 2で ）にした後、フラスコを加湿インキュベーター中、37℃/ 5％CO 2で平衡させて添加する少なくとも30分間。ヒトHUVECは、2,500〜5,000細胞/ cm 2の密度で、この平衡化した培養フラスコに直接播種する。 </li><li>メディアが平衡化されているが、すぐに37℃の水浴中でストックHUVECのクライオバイアルを解凍する。ボルテックスすることにより、元のストレージバイアル中の細胞を分散させ、次いで2,500〜5,000細胞/ cm 2の密度を達成するために事前に平衡化HUVEC完全増殖培地を含む培養フラスコに直接加える。優しく均等に細胞を分配して、インキュベーターにフラスコを返すために、フラスコを揺する。これらの細胞は、現在、1 回目の通過を表す。 </li> &lt;細胞が70〜80％コンフルエントになるまで李&gt;中2日ごとに変更する必要があります。 </li><li> HUVECを現在トリプシン/ EDTAで培養フラスコから収穫することができる。培養培地を細胞から任意の残留タンパク質およびカルシウムを除去するためにPBSでリンスし、培養フラスコから吸引される。 0.25％トリプシン-EDTA溶液を添加し、光学顕微鏡により評価されるように2-6分間の細胞の剥離の中には明らかである。 </li><li> 90％の細胞がプレートから切り上げたとき、2×トリプシンインヒビターを等量加えることによって、トリプシン処理を停止する。細胞の収穫を容易にするために、完全な増殖培地の他の同等の量を追加します。無菌15mL遠心管に分離した細胞を移す。 </li><li>室温で5分間225×gで分離した細胞を遠心分離する。上清を吸引した後、完全増殖培地を2〜3 mlの細胞を再懸濁。血球計およびトリパンブルーを用いて細胞濃度および生存率を測定。 </li><li>目を利用するE研究のための細胞、再シードさらに75 cm / cmで2万個の細胞の密度で細胞と2フラスコを採取し、2.2に進みます。あるいは、細胞は、将来の研究のために、この時点で凍結することができる。細胞凍結のために、室温で5分間、225×gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を吸引除去オフし、1×10 6細胞/ mlの濃度で10％DMSOを含むFBS中で細胞ペレットを再懸濁する。次いで、細胞懸濁液を、細胞凍結容器内に細胞を凍結した後凍結バイアルに移し、-80℃で保存する。 </li></ol> 2。HUVEC層準備<ol><li>凍結された2 番目の通路 HUVECの使用：復活と文化。活発に増殖する細胞を用いる場合は、2.2に進みます。 <ol><li> 37℃の水浴中で迅速にステップ1.8から2 番目の通路のHUVECを含有するクライオバイアルを解凍する。 15ミリリットル滅菌遠心管に凍結バイアルから細胞を移し、10ミリリットルの成長MEDIを追加UM。 </li><li>室温で5分間、200×gで細胞を遠心し、残留DMSOを除去し、上清を吸引除去する。 </li><li>完全な増殖培地で細胞ペレットを再懸濁し、75cm 2のフラスコに細胞を移す。総量約20〜25 mlに増殖培地を追加し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol></li><li>視覚的メディアとの毎日は、2日ごとに変化し、合流のための細胞培養を調べる。通常2-4日以内に、細胞は、フローチャンバーアッセイにおける使用のための準備ができ、その時点で80〜90％コンフルエンスに達する。 </li><li> （セクション5を参照）フローチャンバーで使用される培養皿を調製し、作るために、1〜10μg/ mlのフィブロネクチンmlおよび35mmの組織培養皿ピペット0.05％（w / v）のゼラチンを数回追加必ずプレート全体表面が被覆されている。タンパク質マトリックスの形成を最適化するために、少なくとも30分間、プレートを乾燥させ、過剰なフィブロネクチンとゼラチン水溶液と空気を除去。 Fibronectinゼラチン溶液を10倍まで再利用することができる。 </li><li>ステップ1.5から1.7で説明したようにトリプシン-EDTAを使用して、ステップ2.2からHUVEC細胞を収穫。各コーティングされた組織培養皿に500,000細胞を播種する。各皿に2ミリリットルの増殖培地を追加し、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。 </li><li>細胞はステップ2.2のように密集するまで成長させる。細胞は、視覚的に、2日ごとに培地交換を毎日点検してください。事前のフローチャンバーアッセイと、接着分子の発現をアップレギュレートし、刺激する4-6時間にわたって20 ng / mlのヒトTNF-αでのHUVECの素数。 </li></ol> 3。精製リガンドコーティング<ol><li> 35mm組織培養皿の中央にマーカーやペンで直径0.5cmの円を描きます。 </li><li>プレートマークされたエリア内の20μg/ mlのプロテ​​インAの20μL。タンパク質を直径0.5cmの円内全域をカバーするソリューションを広めるためにピペットチップを使用してください。それは、Dの表面に触れたり傷つけたりしないことが重要ですISH。 1時間37℃でインキュベートする。 </li><li> 1mlのPBS（pH8.0）でタンパク質コートプレートの3回洗浄します。 </li><li>プレートに非特異的結合をブロックするマークされたエリア内のプレートに50μlの1％BSA。 4℃で2時間インキュベート</li><li>ステップ3.3のように、1mlのPBSでブロックし、プレート3回洗浄します。 </li><li>コー​​ティング用のFc接着受容体リガンドキメラタンパク質溶液を調製する。この実験では、25μg/ mlの少なくともICAM-1/Fcキメラ溶液とPBS中の0.5μg/ mlの少なくともP-Selectin/Fcキメラ液（pH8.0）を用いた。 </li><li>コー​​ト基板50μlとマークされたエリア。 4℃で一晩インキュベート料理は2日以内に使用されるべきであり、コーティングされたエリアは、乾燥させてはならない。プレート上の50μlのソリューションを維持するために必要な場合には、PBSを追加します。 </li></ol> 4。好中球の分離（室温で実行されるすべてのステップ） <ol><li>インフォームドコンセントを得た後、に瀉​​血によって参加者の血液を集めるnは抗凝固採血管またはバキュテナー（EDTAまたはヘパリン）。採血後、分離前のPBSで血液1:1希釈する。 </li><li> 50ミリリットル遠心管にPBMCおよび好中球を分離するための2層のFicollを準備します。最初の15ミリリットル重いフィコールを（材料のリストを参照して、ρ= 1.118から1.120）追加してから、慎重に10ミリリットルを重ね重いのFicollの上に（材料のリスト、ρ= 1.077から1.080を参照）フィコールを照らす。軽フィコールと重いフィコール層の間の鋭い境界線があるはずです。最後に、注意深くフィコール層を乱すことなく光のFicollの上に希釈された血液サンプル25mlのレイヤ。 </li><li>室温で30分間250×gでチューブを遠心分離する。注：これらのスピンは、遠心分離の終了時にローター減速中の細胞分離の可能性混乱を最小限に抑えるために遠心ローターブレーキはオフにする必要があります。遠心分離した後、（上から下へ）以下の層が存在している：トップ層は、プラズマfolloです光フィコール層の上にPBMC層によって結婚、いくつかの赤血球（RBC）と好中球の層がチューブの底に重フィコール層および赤血球続い軽鎖および重フィコールの間である。 </li><li>収穫し、室温で10分間、225×gで50ml及び遠心分離機の最終体積にPBSを追加し、移送ピペットを用いて新たな50mlチューブへの好中球層を転写する。 <ol><li>遠心分離後、依然として好中球と混合したRBCがあってもよい。ダウン10ミリリットルマークに上清を吸引除去する。チューブ（または簡単な低速ボルテックス）の穏やかな撹拌によって好中球赤血球ペレットを再懸濁し、PBS 50mlで再び洗う。 </li></ol></li><li>二回目の洗浄後、上清を吸引除去する。夾雑赤血球を除去するには、攪拌（または短いボルテックス）による残留PBS中ペレット化した細胞を再懸濁、RBCを溶解する10秒25ミリリットルのH 2 Oを、ゆっくりと渦を追加します。 <ol><li> 1.8％NaClを25ミリリットルを加え、すぐに混ぜる室温で10分間、225×gで遠心分離することによって。汚染したRBCは現在、白、好中球の細胞ペレットを残して溶解する必要があります。 </li></ol></li><li> PBSで好中球の細胞ペレットを洗浄します。 </li><li> 10％FBSを含むRPMI培地中で孤立した好中球を再懸濁し、血球計算板と光学顕微鏡下で細胞濃度を決定する。 </li><li>完全なRPMI-10％FBS培地で500,000細胞/ mlに細胞濃度を調整。 </li></ol> 5。フローチャンバー接着アッセイ<ol><li>フローチャンバーを組み立てます。顕微鏡テーブルの上にコンフルエントのHUVECまたは精製された接着性受容体リガンドを含む35mmディッシュを置きます。シリンジポンプ、真空システムと平行板フローチャンバーを接続し、好中球の入力のために開いた1行のままにします。プレートの上部にフローチャンバーを挿入し、フローチャンバアセンブリ13を固定します。 （ 図1を参照してください） </li><li> T接続されたコンピュータ上のビデオ録画プログラムを開始顕微鏡O。リガンド塗布領域内に十分に成長したHUVEC細胞またはフィールドとの明確なフィールドが表示されるまで、顕微鏡のフィールドとフォーカスを調整します。 </li><li>シリンジポンプを用いて、RPMI培地でフローチャンバーをすすぐ。チャンバー内に気泡や好中球の入力行がないことを確認してください。 </li><li>所望であれば、好中球は10分間、低用量（10 -8 M）のfMLPで下塗りしてもよい。これは異なるドナー14の間に好中球活性化の基礎レベルのマッチングを可能にする。 </li><li>定義された速度（1.5ダイン/ cm 2の剪断応力がこの研究で使用されているに等しい350μlの/分の速度）でのフローチャンバーへの好中球を注入するためにシリンジポンプを使用する。ビデオを録画。好中球の接着が急速に発生する可能性があるため、4〜5分の長さのビデオは、分析のための接着事象を定量するために通常は十分です。 </li><li>接着細胞は、1つのセル直径よりも小さいセルを移動させるように定義されるHUVECまたはリガンドでコーティングされた表面15,16上の5秒以内。このルールを使用して記録された映像に存在するフィールドで接着細胞の総数をカウントします。異なるドナーの好中球と同様の長さの動画を記録することによって、人は異なるドナーとの密着性を比較するために接着細胞/分を計算することができる。 </li></ol>

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	<li>Harley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+in+women+with+systemic+lupus+erythematosus+identifies+susceptibility+variants.">Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants.</a> in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+ICAM1-ICAM4-ICAM5+Locus+Is+Associated+with+Systemic+Lupus+Erythematosus+Susceptibility+in+Multiple+Ancestry+Populations.">Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations.</a> Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+leukocyte+recruitment+in+the+inflammatory+process.">Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process.</a> Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).</li><li>Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neutrophil-endothelial+cell+adhesion+in+inflammatory+disorders.">Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders.</a> J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).</li><li>Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+inflammatory+injury.">Adhesion molecules and inflammatory injury.</a> FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).</li><li>Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+of+LFA-1+and+Mac-1+with+intercellular+adhesion+molecule-1+in+facilitating+adherence+and+transendothelial+migration+of+human+neutrophils+in+vitro.">Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro.</a> J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).</li><li>Marlin, S. D., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+intercellular+adhesion+molecule-1+(ICAM-1)+is+a+ligand+for+lymphocyte+function-associated+antigen.">Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen.</a> Cell. 51 (5), 813-819 (1987).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+Distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65 (5), 859-873 (1991).</li><li>Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+steps+involved+in+the+transition+to+stationary+adhesion+of+rolling+neutrophils:+A+brief+review.">Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review.</a> Microcirculation. 7, 385-394 (2000).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).</li><li>van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+a+parallel-plate+flow+chamber+for+studying+cellular+adhesion+to+solid+surfaces.">Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).</li><li>Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+flow+in+the+parallel+plate+flow+chamber:+Implications+for+cell+capture+studies.">Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies.</a> Biophys. J. 67, 889-895 (1994).</li><li>Kucik, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Adhesion+Under+Flow+Conditions.">Measurement of Adhesion Under Flow Conditions.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Lupus+Associated+ITGAM+Variants+Alter+Mac-1+Function+on+Neutrophils.">Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils.</a> Arthritis. Rheum. , (2013).</li><li>Bacabac, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shear+stress+in+parallel-plate+flow+chambers.">Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers.</a> J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).</li><li>Kucik, D. F., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., C, A., Zychlinsky, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. 36 (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J Vis Exp. (17), 745 (2008).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species.">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li><li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans.">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、全くのストレス条件下で好中球の接着を慎重に定量化のための最小限の活性化好中球の分離および単離をガイドします。好中球の接着は、炎症において重要なプロセスである。このプロセスにおける複数の分子の遺伝的変異体が自己免疫疾患の発症1,2素因が実証されているので、定量的に、ヒト好中球の強固な接着を評価することが可能なアッセイ系が必要である。このプロトコルに記載された方法は、せん断応力下での制御のin vitro環境での好中球の強固な接着性を慎重にかつ定量的な測定を可能にする。従って、この方法は、個体間の遺伝子型同定、定量好中球接着の直接的な比較は接着分子14における遺伝的変異の重要性を決定することを可能にする。 この方法にはいくつかのステップがachievを十分考慮に値するEの高い定量的かつ再現性のある結果。 HUVECの調製においては、フローチャンバーでそれらを使用する前に100％の細胞集密度を達成するために重要である。精製されたリガンドで被覆された表面を使用するため、基板の塗布面積は、リガンドの変性を避けるために完全に乾燥した許可すべきではない。さらに、ヒト好中球の調製は、実験の成功に不可欠です。血液から好中球を単離における重要な問題を穏やかに活性化を回避するためにボルテックスを最小化することによって処理し、室温で細胞を維持する（ すなわち、血液は室温で行われるべき氷および遠心分離ステップに記憶されるべきではない）と、単離および実験を完了含む可能な限り最短の時間内。また、これらのアッセイ17,18用の細胞を調製するために利用することができる追加の好中球の単離方法がある。 新たに単離されたヒト好中球を使用した実用的な観点からは、接着アッセイから<html>参加者の瀉血後3-6時間以内に開始しなければならない。好中球は取り扱いに非常に敏感であるため、採血と使用の間に長期の時間が検定結果に影響を与える可能性があります。従来のフローチャンバーアッセイに好中球細胞濃度を注意深く決定は、正確で再現性のある結果を達成することも必要である。 フローチャンバーアッセイ中に、流速が一致しており、実験期間全体にわたって乱流が存在しないことを保証するために慎重にビデオ記録を監視することが重要である。流速の変化や乱流の存在は、実験が繰り返されることを必要とするであろう。実験後は、好中球が凝集されないことを保証するために、微視的に残り、好中球を評価することも重要である。この時点での凝集は、好中球が有意に実験中の好中球の密度を変化させる可能性が活性化されたことを示すであろう。 コンテンツ&quot;&gt;フローチャンバーは、Qが=流量をチャンバ内に近い均質なせん断応力（τ=6Qμ/（WH 2）、μ=動粘度、およびフローチャンバーのW =幅、のH =高さを作成しますフローチャンバ15）。我々の研究において、我々は、1.5ダイン/ cm 2（0.25センチメートル、時間=ワットのせん断応力を作成する好中球の接着のために350μlの/分の流速を使用したが= 0.01インチ、水の粘度37℃でC（0.007ポアズ））をRMPI培地の粘度の近似値として使用した。特定のフローチャンバーは、一方が異なる生理学的条件を模倣するせん断応力の異なるレベルを達成するために流量を変更することができる。典型的な生理学的な剪断応力ヒト血管中0.5〜ダイン/ cm 13,16の間の範囲は、他の血管および他の動物におけるせん断応力は、表1 113,16,19 20に列挙したができる。 私たちの方法は、ヒトneutrophiの付着の研究に焦点を当てているがlsの、この方法は、好中球に限定されず、容易に接着または単純な変更を加えて他の細胞タイプの圧延の研究に適用することができる。また、この方法では基板は、異なる目的のために変更することができる。 このプロトコルは異なる研究に容易に適合しているが、いくつかの制限があります。ここに実装されているプロトコルは、分析のための主要な多数の細胞を必要とします。これは、小さな動物からの初代細胞の分析を排除することがあります。さらに、アクティブ/使用可能なコンホメーションで精製された接着リガンドを固定化する必要性は配位子の範囲を制限することができる。 Fc融合タンパク質の使用が大幅に板面に適切なリガンドコンフォメーションを達成する可能性を高める。それにもかかわらず、我々の方法は、接着事象の定量分析を可能にする重要な柔軟性を有する。これらの研究は、非常に私たちの接着受容体 - リガンド対の理解、および遺伝的変異の可能性のある機能の重要性を強化しますこれらのタンパク質は、ヒト疾患の病因である。

両方のβ2インテグリンおよびICAMリガンドの遺伝的変異体は現在、自己免疫疾患の1,2の発症に関連すると認識されている。これらの変異型を持つ個体に由来する細胞におけるこれらの変異体の機能的結果の決定は、これらの変異体は、自己免疫疾患の病因に寄与するかについての我々の理解のために必要である。そのような機能的研究は、天然に存在する遺伝的変異は、健康および疾患の両方における免疫応答を形成する機構の決定を可能にする。 SLEの具体例において、我々は今、ITGAMにおける変異（のCD11b）およびそのリガンド、ICAM-1、1,2強く疾患の発症に関連付けることを知っている。好中球は炎症反応で重要であるため、好中球の接着の定量的研究は、ITGAM / ICAMの炎症を変える方法遺伝的変異に機械論的な洞察を提供することがあります。 Neutrop細胞（EC）を内皮HIL強固な接着は、高度に制御されたプロセスであり、炎症反応3,4において重要な役割を果たしている。好中球の強固な接着は、ECの初期好中球の転がりとキャプチャをたどり、最終的には、生体内で輪廻する可能性があります。これらのプロセスは、内皮細胞上のICAM-1などの接着分子、ICAM-2、P-セレクチン、E-セレクチン、多くの異なる種類が関与し、好中球5-9 2インテグリンβ。このように、接着分子の異なる対立遺伝子変異体を有するドナーからの好中球の接着を慎重に定量化は、これらの遺伝的変異の機能的および病理学的結果を理解することが重要になります。 フローチャンバーの実験的使用は、 インビボ 10-12 における血管環境で観察されたものと同様の流体せん断応力を用いたin vitro環境を作成することができる。実際に、フローチャンバーアッセイは、ヒトumbiliと結合校正静脈内皮細胞（HUVEC）は、血管のin vivo環境を模倣することができる。この方法を使用すると、1は、内皮細胞に向けた全体的な細胞接着性を学ぶことができます。さらに、フローチャンバの高度に制御された環境はまた、細胞の評価は、特定の受容体 - リガンド相互作用の研究を容易にするために、例えばICAM-1などの精製された接着リガンドへの結合を可能にする。 ここでは、HUVECに、精製されたリガンドの基材に、ヒト末梢血の好中球の接着特性を研究するためのフローチャンバー接着アッセイ系を利用する方法を提示する。別の接着分子の対立遺伝子変異体を発現するドナーからの細胞を用いてこの方法を使用すると、私たちは、これらの遺伝的変異は、ヒト好中球の強固な接着を変更することができますどのように評価することができます。

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		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

内皮細胞への好中球の強固な接着は、健康と病気の両方で炎症において重要な役割を果たしている。好中球の強固な接着の方法は、β2インテグリンファミリーのメンバーおよびICAMファミリーのカウンター受容体を含む多くの異なる接着分子を含む。最近では、両方で天然に存在する遺伝的変異は、2インテグリンβとのICAMは、自己免疫疾患と関連することが報告されています。したがって、これらの接着分子の様々な対立遺伝子型を持つ個体からの好中球の定量的接着能力は自己免疫の発生のメカニズムに関連して検討することが重要である。フローチャンバーシステムにおける接着試験は、 インビボで血管環境で観察されたものと同様の流体せん断応力を有する環境を作成することができる。ここで、我々は、ヒト末梢血の好中球の定量的な接着特性を研究するために、フローチャンバーアッセイ系を用いる方法を提示ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、精製されたリガンド基板秒。この方法では、接着受容体の異なる対立遺伝子変異体を有するドナー由来の好中球の接着能力を評価し比較することができる。この方法はまた、他の一次細胞型または細胞株の接着を評価するために修飾することができる。

好中球の例としては、精製されたリガンド（ICAM-1/P-Selectin）コーティングされたフローチャンバー（ 図2）またはHUVECコ ​​ーティングされたフローチャンバーアッセイ（ 図3）に結合する好中球への結合が示されている。図に示すように、好中球は連続的な流れの条件でコーティングされた表面またはHUVECに付着/蓄積し続ける。私たちの典型的な実験条件の下で、私たちはしっかりと4分間の記録期間中にコーティングされた表面またはHUVECに付着した50〜70人の好中球を観察することができます。しかし、好中球接着分子、または基質（精製リガンドまたはHUVEC）における対立遺伝子変異体の対立遺伝子変異体は、実質的に定量的な好中球の接着14を変化させることができる。 我々はまた、我々の研究で観察された好中球の接着のイベントの時間依存性を評価している。我々は、一定の流量条件を維持している間、それは細胞の接着特性が経時的に変化することが可能である。 However、私たちの研究では、比較的短い時間のコースにわたって、我々は時間をかけて接着力率のいずれかの一貫性の違いを観察しません。例えば、3〜4分間の時間点の間で観察さ接着と比較して1〜2分の時点での密着性の評価は、一貫して異なっていない。細胞が接着実験中に刺激されている場合はもちろん、次いで、経時的な接着特性の変化が期待できる。 我々の研究では、我々は意図的に試験前に10分間、低用量のfMLP（10 -8 M）で細胞をプライミングすることによって単離誘導好中球活性化を制御する。内皮細胞（私たちの研究でHUVEC）を、最適な白血球強固な接着のための接着分子の発現をアップレギュレートする前に活性化を必要とする。前処理の非存在下で、内皮細胞（HUVEC）は、非常に少ない好中球の接着を支援する。我々の研究では、10 ng / mlの使用前に4-6時間、TNFα治療を用いる。 IL-1β（10 ng / mlの）と<html> LPS（0.5μg/ mlの）はまた、内皮細胞を予め活性化するために使用することができる。重要なことに、未処理のHUVEC細胞接着は、特定の（受容体媒介性）好中球 - 内皮細胞相互作用によって引き起こされることを保証するためにネガティブコントロールとして使用することができる。あるいは、抗受容体抗体は、密着性の特異性を評価するために、特定の受容体を遮断するために使用することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> 顕微鏡ステージ上の図1。フローチャンバー構成は <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; 図2異なる時点（Aでコーティングされた表面をICAM-1/P-Selectinに付着した好中球のサンプルビデオからのスクリーンショット：0時点、B：1分の時点、C：2分の時点、およびD： 4分の時点）。 ICAM-1の濃度は25μg/ mlのであり、P-セレクチンは、0.5μg/ mlのである。好中球の流速は500,000細胞/ mlの好中球の密度を有する350μlの/分である。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> 図3種々の時点で、HUVECコ ​​ーティングされた表面に付着した好中球のサンプルビデオからのスクリーンショット。（A：0時点、B：1分の時点、C：2分の時点、およびD：4分の時点）。好中球の流速は500,000細胞/ mlの好中球の密度を有する350μlの溶液/である。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td>種</td><td >場所</td><td >剪断応力（ダイン/ cm 2） </td></tr><tr ><td>人間</td><td>共通caroid動脈</td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>鰓動脈</td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>総大腿動脈</td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>副腎大動脈</td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td>人間</td><td> Supraceliac大動脈</td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>浅fermoral動脈</td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>細静脈</td><td> 0.5〜5.0 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>網膜最初の細動脈</td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>網膜細動脈秒</td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>網膜最初の細静脈</td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td>人間</td><td>網膜二細静脈</td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td>犬</td><td>共通caroid動脈</td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td>ウサギ</td><td>共通caroid動脈</td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td>ラット</td><td>共通caroid動脈</td><td> 46.​​6 </td></tr><tr ><td>マウス</td><td>共通caroid動脈</td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td>犬</td><td>総大腿動脈</td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td>ウサギ</td><td>総大腿動脈</td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td>ラット</td><td>総大腿動脈</td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> 異なる器官及び異なる種の表1。サンプルせん断応力。 *参考文献13、16、19、及び20からの集計。

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Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

ヒト好フローチャンバー接着アッセイ

好中球の接着を定量する方法が報告されている。この方法は、血管内に発生したものと同様の動的流れ環境を作成する。これは、せん断応力との生体内環境に似コンテキストで精製された接着分子（リガンド）のいずれかへの好中球の接着や内皮細胞基質（HUVEC）の調査を可能にする。

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

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ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

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定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

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