Name: human neutrophil flow chamber adhesion assay
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay at JoVE.com

Эта работа проводится при финансовой поддержке Lupus исследовательского института (Нью-Йорк, Нью-Йорк), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 и NIH UL1-TR00165. Мы благодарим доктора Роберта П. Кимберли за его постоянную поддержку.

<ol>
	<li>Harley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+in+women+with+systemic+lupus+erythematosus+identifies+susceptibility+variants.">Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants.</a> in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+ICAM1-ICAM4-ICAM5+Locus+Is+Associated+with+Systemic+Lupus+Erythematosus+Susceptibility+in+Multiple+Ancestry+Populations.">Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations.</a> Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+leukocyte+recruitment+in+the+inflammatory+process.">Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process.</a> Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).</li><li>Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neutrophil-endothelial+cell+adhesion+in+inflammatory+disorders.">Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders.</a> J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).</li><li>Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+inflammatory+injury.">Adhesion molecules and inflammatory injury.</a> FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).</li><li>Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+of+LFA-1+and+Mac-1+with+intercellular+adhesion+molecule-1+in+facilitating+adherence+and+transendothelial+migration+of+human+neutrophils+in+vitro.">Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro.</a> J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).</li><li>Marlin, S. D., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+intercellular+adhesion+molecule-1+(ICAM-1)+is+a+ligand+for+lymphocyte+function-associated+antigen.">Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen.</a> Cell. 51 (5), 813-819 (1987).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+Distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65 (5), 859-873 (1991).</li><li>Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+steps+involved+in+the+transition+to+stationary+adhesion+of+rolling+neutrophils:+A+brief+review.">Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review.</a> Microcirculation. 7, 385-394 (2000).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).</li><li>van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+a+parallel-plate+flow+chamber+for+studying+cellular+adhesion+to+solid+surfaces.">Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).</li><li>Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+flow+in+the+parallel+plate+flow+chamber:+Implications+for+cell+capture+studies.">Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies.</a> Biophys. J. 67, 889-895 (1994).</li><li>Kucik, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Adhesion+Under+Flow+Conditions.">Measurement of Adhesion Under Flow Conditions.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Lupus+Associated+ITGAM+Variants+Alter+Mac-1+Function+on+Neutrophils.">Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils.</a> Arthritis. Rheum. , (2013).</li><li>Bacabac, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shear+stress+in+parallel-plate+flow+chambers.">Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers.</a> J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).</li><li>Kucik, D. F., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., C, A., Zychlinsky, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. 36 (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J Vis Exp. (17), 745 (2008).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species.">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li><li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans.">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Этот протокол направляет разделение и изоляцию минимально активированных нейтрофилов для тщательного количественного нейтрофилов адгезии под отвесными условиях стресса. Нейтрофилов адгезия критический процесс в воспалении. Поскольку генетические варианты в нескольких молекул в этом процессе были продемонстрированы предрасполагают к развитию аутоиммунного заболевания 1,2, анализ система способна количественно оценить нейтрофилов человека твердое сцепление не требуется. Способ, описанный в данном протоколе позволяет тщательного и количественного определения твердой клейкой потенциала нейтрофилов в контролируемой среде в пробирке под чистой стресса. Этот метод позволяет, таким образом прямое сравнение количественного нейтрофилов адгезии между генотипированных лиц, чтобы определить важность генетической изменчивости в адгезионных молекул 14. Несколько шагов в этом методе заслуживает отдельного рассмотрения в резуэ высоко количественные и воспроизводимые результаты. При подготовке HUVEC, крайне важно для достижения 100% слияния клеток, прежде чем использовать их в проточной камеры. Для использования поверхности, покрытые очищенным лиганда, площадь подложки покрытие никогда не должны высыхать, чтобы избежать денатурации лиганд. Кроме того, подготовка нейтрофилов человека имеет решающее значение для успеха эксперимента. Ключевые вопросы в изоляции нейтрофилы из крови включают мягко обработки за счет минимизации вихревание, чтобы избежать активации, сохраняя клетки при комнатной температуре (то есть кровь не следует хранить на льду и центрифугирования шаги должны быть выполнены при комнатной температуре) и выполняя выделение и эксперимент в наименьшее количество времени, как это возможно. Существуют дополнительные методы изоляции нейтрофилов, которые также могут быть использованы для подготовки клеток для этих анализов 17,18. С практической точки зрения, адгезии анализов с помощью Свежевыделенные нейтрофилов человека<html> должна быть начата в течение 3-6 ч после участника кровопускания. Как нейтрофилы чрезвычайно чувствительны к внешнему воздействию, продолжительное время между взятия крови и использования может повлиять опробования результатов. Тщательное определение концентрации клеток нейтрофилов до проточную камеру анализа также необходимо достичь точных и воспроизводимых результатов. В ходе анализа проточной камеры, важно контролировать видеозапись тщательно, чтобы гарантировать, что скорость потока последовательной и нет турбулентность по всей длине эксперимента. Изменения в скоростях потока или наличие турбулентности потребует, что эксперимент повторить. После эксперимента, важно также, чтобы оценить оставшиеся нейтрофилы микроскопически чтобы гарантировать, что нейтрофилы не слипания. Слипания в этот момент будет означать, что нейтрофилы стали активированный которые могли бы существенно изменить плотность нейтрофилов в ходе эксперимента. Содержание &quot;&gt; Проточная камера создает около однородной чистой стресс внутри камеры (τ = 6Qμ / (WH 2), где Q = расход, μ = динамическая вязкость и Ш = ширина камеры потока, Н = высота камеру 15 потока). В наших исследованиях мы использовали скорость потока 350 мкл / мин для нейтрофилов присоединения, который создает истинное напряжение 1,5 дин / см 2 (W = 0,25 см, Н = 0,01 дюйма, вязкость воды при 37 ° С (0,007 пуаз) был использован в качестве приближения вязкости RMPI носителя). Для конкретного проточной камеры, можно изменять скорость потока для достижения различных уровней чистого стресса, чтобы имитировать различные физиологические условия. Типичное напряжение сдвига физиологический в кровеносных сосудах человека может диапазоны между 0,5-5,0 дин / см 13,16. напряжение сдвига в других кровеносных сосудов и других животных были представлены в таблице 1 113,16,19 20. В то время как наш метод была сосредоточена на изучении адгезии человека neutrophiлс, этот способ не ограничивается нейтрофилов и может быть легко применен к адгезии или прокатки исследований других типов клеток с простых модификаций. Кроме того, подложки в этом методе может быть изменен для различных целей. Хотя этот протокол легко адаптируется к различным исследованиям, есть некоторые ограничения. Протокол, как реализуется здесь требуется большое количество первичных клеток для анализа. Это может препятствовать анализ первичных клеток из мелких животных. Кроме того, необходимость иммобилизации очищенных адгезионные лиганды в активном / доступны конформации может ограничить диапазон лигандов. Использование Fc-слитых белков значительно повышает шансы на достижение надлежащего лиганда конформацию на поверхности пластины. Тем не менее, наш метод имеет значительную гибкость, чтобы позволить количественный анализ адгезии событий. Эти исследования значительно повысит наше понимание рецептор-лиганд пар адгезии и потенциальную функцию важность генетических вариантовв этих белков, в патогенезе заболеваний человека.

Генетические варианты в обоих β 2 интегринов и в ICAM лигандов в настоящее время признается, связаны с развитием аутоиммунных 1,2 заболевания. Определение функциональных последствий этих вариантов в клетках, полученных от физических лиц с этих вариантов необходимо для нашего понимания того, как эти варианты способствовать патогенезе аутоиммунного заболевания. Такие функциональные исследования позволяют для определения механизмов, посредством которых природные генетические варианты формируют иммунную реакцию как в норме и при патологии. В конкретном примере, СКВ, мы теперь знаем, что варианты в ITGAM (CD11b) и его лиганд, ICAM-1, сильно ассоциируется с развитием болезни 1,2. Потому что нейтрофилы имеют решающее значение в воспалительных реакциях, количественное исследование нейтрофилов адгезии может обеспечить механистические понимание того, как генетические варианты в ITGAM / ICAM изменить воспаление. NeutropХиль твердую адгезии эндотелиальных клеток (ЭК) является весьма регулируемым процессом и играет существенную роль в воспалительных реакциях 3,4. Фирма адгезия нейтрофилов следует первоначальный нейтрофилов прокатки и захват на ЕС и в конечном итоге может привести к переселению в естественных условиях. Эти процессы включают много различных видов молекул адгезии, включая ICAM-1, ICAM-2, Р-селектин, E-селектин на эндотелиальных клетках и β 2 интегрины на нейтрофилов 5-9. Таким образом, тщательное количественное нейтрофилов адгезии от доноров с различными аллельных вариантов молекул адгезии будет важно понять, функциональные и патологические последствия этих генетических вариантов. Экспериментальное использование проточной камеры может создать среду, в пробирке с напряжением сдвига жидкости аналогичной той, которая наблюдается в среде кровеносного сосуда в естественных условиях 10-12. Действительно, камера поток анализа в сочетании с человеческой umbiliкал вены эндотелиальных клеток (HUVEC) могут имитировать окружающую среду в естественных условиях кровеносного сосуда. Используя этот метод, можно изучать общие клеточные адгезионные свойства по отношению к эндотелиальных клеток. Кроме того, весьма контролируемой среде проточной камеры также позволяет оценить клетки связывания с очищенными адгезии лигандов, таких как ICAM-1, чтобы облегчить изучение конкретных рецептор-лиганд. Мы приведем здесь метод, использующий систему Пробирной палаты поток адгезии для изучения адгезионные свойства нейтрофилов периферической крови человека, HUVEC и очищенных лигандов субстратов. Используя этот метод с клетками доноров, выражающих различные варианты аллельных адгезии позволяет оценить, как эти генетические варианты могут изменить человека нейтрофилов твердую адгезию.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

Нейтрофилов фирма адгезия к эндотелиальных клеток играет важную роль в воспалении в обоих здоровья и болезни. Процесс нейтрофилов фирмы адгезии включает в себя множество различных молекул адгезии, включая членов семейства интегринов β 2 и их контр-рецепторов семейства ICAM. В последнее время природные генетические варианты в обоих β 2 интегрины и ICAMs, как сообщается, связана с аутоиммунным заболеванием. Таким образом, количественный клей емкость нейтрофилов от физических лиц с различными аллельных форм этих молекул адгезии важно изучить в отношении механизмов, лежащих в основе развития аутоиммунных. Адгезии исследования в системах проточной камеры может создать среду с напряжением сдвига жидкости аналогичной той, которая наблюдается в среде кровеносного сосуда в естественных условиях. Здесь мы представляем метод с использованием системы Проточная камера анализа для изучения количественных адгезионные свойства человеческой периферической крови нейтрофиловс до пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC) и очищенных лиганд субстратов. С помощью этого метода нейтрофилов клейкие мощности от доноров с различным аллельных вариантов в рецепторов адгезии могут быть оценены и сравнены. Этот способ также может быть модифицирован с целью оценки адгезии других типов первичных клеток или клеточных линий.

Примеры нейтрофилов привязки к очищенной лиганда (ICAM-1/P-Selectin) покрытием проточной камеры (рис. 2) или нейтрофилов обязательного к HUVEC покрытием камеры поток анализа (рис. 3) показаны. Как показано на чертежах, нейтрофилы продолжают накапливаться / прилипать к поверхности, покрытой или HUVEC в условиях непрерывного потока. В наших типичных условий эксперимента, мы можем наблюдать 50-70 нейтрофилов человека твердо придерживаясь покрытием поверхности или HUVEC в течение четырех-минутного периода записи. Тем не менее, аллельные варианты молекул адгезии нейтрофилов, или аллельных вариантов в субстрате (очищенный лиганд или HUVEC), может существенно изменить количественный нейтрофилов адгезии 14. Мы также оценили зависимость от времени нейтрофилов адгезии событий, наблюдаемых в наших исследованиях. В то время как мы поддерживаем условия постоянный поток, вполне возможно, что адгезионные свойства клеток изменяются с течением времени. Нowever, за относительно короткие курсы времени в наших исследованиях, мы не наблюдаем никаких существенных различий в скорости адгезии с течением времени. Например, оценки адгезии на 1-2 пункта минуту времени по сравнению с адгезией наблюдается между 3-4 мин моменты времени не последовательно разные. Конечно, если стимулируются клетки в ходе эксперимента адгезии, то изменения в адгезионных свойств с течением времени можно было ожидать. В наших исследованиях мы контролировали изоляции индуцированной активации нейтрофилов, намеренно грунтовки клетки с низкой дозой ФМЛФ (10 -8 М) в течение 10 мин до начала исследования. Эндотелиальные клетки (HUVEC в наших исследованиях) также требуют предварительной активации повышать экспрессию молекулы адгезии для оптимального лейкоцитов фирмы адгезии. При отсутствии предварительной обработки, эндотелиальные клетки (HUVECs) будет поддерживать очень мало нейтрофилов адгезии. В наших исследованиях мы использовали 10 нг / мл лечение ФНО для 4-6 часа до использования. IL-1β (10 нг / мл) и<html> ЛПС (0,5-1 мкг / мл) также могут быть использованы предварительно активировать эндотелиальные клетки. Важно отметить, что необработанный HUVEC может быть использован в качестве отрицательного контроля, чтобы обеспечить адгезию клеток обусловлено специфических (рецептор-опосредованного) нейтрофилов и эндотелиальных клеток взаимодействий. Альтернативно, антитела анти-рецепторов могут быть использованы, чтобы блокировать специфические рецепторы, чтобы оценить специфичность адгезии. <img alt="Рисунок 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> Рисунок 1. Конфигурации проточной камеры на столик микроскопа. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; Выстрелы Рисунок 2 экрана от образца видео нейтрофилов, придерживающихся ICAM-1/P-Selectin поверхность, покрытую в различные моменты времени (:. 0 момент времени, В: 1 раз мин точка, C: 2 раз мин точка, и D: 4 мин момент времени). Концентрация ICAM-1 25 мкг / мл и P-селектин 0,5 мкг / мл. Скорость потока нейтрофилов 350 мкл / мин с плотностью нейтрофилов при 500000 клеток / мл. <img alt="Рисунок 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> Отношение Рисунок 3 Экран из образца видео нейтрофилов прилипших к поверхности, покрытой HUVEC в различные моменты времени (А: 0 момент времени, B: 1 мин момент времени, C: 2 раз мин точкой, и D: 4 мин момент времени)..Скорость потока нейтрофилов 350 мкл / мл с плотностью нейтрофилов при 500000 клеток / мл. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> Вид </td><td > Расположение </td><td > Напряжение сдвига (дин / см 2) </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Общие caroid артерии </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Жаберный артерии </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Общие бедренной артерии </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Надпочечников аорты </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Supraceliac аорты </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Поверхностная fermoral артерии </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Венулы </td><td> 0,5-5,0 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Сетчатки первые артериол </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Сетчатки второго артериол </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Сетчатки первые венул </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> Человек </td><td> Сетчатки второго венул </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> Собака </td><td> Общие caroid артерии </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> Кролик </td><td> Общие caroid артерии </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> Крыса </td><td> Общие caroid артерии </td><td> 46.6 </td></tr><tr ><td> Мышь </td><td> Общие caroid артерии </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> Собака </td><td> Общие бедренной артерии </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> Кролик </td><td> Общие бедренной артерии </td><td> 156,8 </td></tr><tr ><td> Крыса </td><td> Общие бедренной артерии </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> Стресс Таблица 1. Пример сдвига в различных органах и различных видов. * Представлены с ссылками 13, 16, 19, и 20.

Watch this Scientific Journal Video about Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay at JoVE.com

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Нейтрофилов человека Проточная камера Адгезия Анализ

Способ количественного нейтрофилов адгезию сообщается. Этот метод создает динамическую среду потока аналогичной той, что встречается в кровеносном сосуде. Это позволяет исследование нейтрофилов адгезии к или очищенных молекул адгезии (лиганда) или эндотелиальных клеток подложки (HUVEC) в контексте подобной окружающей среды в естественных условиях с чистой стресса.

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Пробирной бактериальной адгезии на эпителиальных клетках млекопитающих

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Выделение пупочной вены человека эндотелиальных клеток и их использование в изучении нейтрофилов Переселение в проточных условиях

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Расход Адгезия Анализ по изучению лейкоцитов набора на человека печеночных синусоидальных эндотелия в условиях напряжения сдвига

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Адгезию динамической Assay для функционального анализа антиадгезионное терапии в воспалительных заболеваний кишечника

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Подготовка цельного костного мозга для анализа массовой цитометрии нейтрофил-линейных клеток

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...