Name: thin-layer chromatographic (tlc) separations and bioassays of plant extracts to identify antimicrobial compounds
Uploaded: 2014-03-27T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds at JoVE.com

Wij danken wijlen Dr Norm Taylor, Dept Plant and Soil Science aan de Universiteit van Kentucky, voor het mogelijk maken om de monsters van zijn rode klaver percelen voor deze studie. Dit project werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van Landbouw.

1. Voorbereiding van Plant Extract <ol><li> Zie Kagan en Flythe 10 voor de extractie van fenolische verbindingen van Trifolium pratense cv. Kenland. </li><li> Om andere verbindingen te extraheren in andere planten, controleer dan de fytochemische analyse literatuur voor planten-of metaboliet-specifieke extractie methoden (velen zijn beschreven), of kijk naar protocollen zoals die van Khurram et al.. 7,8 die veel verbindingen te isoleren met een brede waaier van polariteiten. </l...

<ol>
	<li>Stahl, E., Ashworth, M. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thin-layer chromatography. , (1969).</li><li>Marston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+with+biological+detection+in+phytochemistry.">Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 .</li><li>Homans, A. L., Fuchs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bioautography+on+thin-layer+chromatograms+as+a+method+for+detecting+fungitoxic+substances.">Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances.</a> J. Chromatogr. 51, 327-329 .</li><li>Lund, B. M., Lyon, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+inhibitors+of+Erwinia+carotovora+and+E.+herbicola+on+thin-layer+chromatograms.">Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms.</a> J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).</li><li>Betina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioautography+in+paper+and+thin-layer+chromatography+and+its+scope+in+the+antibiotic+field.">Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field.</a> J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).</li><li>Weltzien, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ein+biologischer+Test+f&#252;r+fungizide+Substanzen+auf+dem+Papierchromatogramm.">Ein biologischer Test f&#252;r fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm.</a> Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).</li><li>Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activities+of+Dodonaea+viscosa+using+contact+bioautography+technique.">Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique.</a> Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).</li><li>Khurram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+anticandidal+potential+of+Quercus+baloot+Griff.+using+contact+bioautography+technique.">Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique.</a> Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).</li><li>Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Organic Constituents of Higher Plants. , (1963).</li><li>Kagan, I. A., Flythe, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+separation+and+bioactivity+of+red+clover+(Trifolium+pratense)+extracts+assayed+against+Clostridium+sticklandii,+a+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium.">Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium.</a> Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).</li><li>Mattila, P., Kumpulainen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+and+total+phenolic+acids+in+plant-derived+foods+by+HPLC+with+diode-array+detection.">Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection.</a> J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).</li><li>Hamburger, M. O., Cordell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+bioautographic+TLC+assay+for+compounds+possessing+antibacterial+activity.">A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity.</a> J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).</li><li>Flythe, M., Kagan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+effect+of+red+clover+(Trifolium+pratense)+phenolic+extract+on+the+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium,+Clostridium+sticklandii.">Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii.</a> Curr. Microbiol. 61, 125-131 .</li><li>Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioautographic+agar+overlay+method+for+the+detection+of+antifungal+compounds+from+higher+plants.">A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants.</a> Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).</li><li>Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antigonococcal+activity+of+Coscinium+fenestratum+stem+extract.">In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract.</a> J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).</li><li>Stahl, E., Kaldewey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spurenanalyse+physiologisch+aktiver,+einfacher+Indolderivate.">Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate.</a> Hoppe-Seyler&#8217;s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 .</li><li>Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ecotype+variability+in+camalexin+production+and+reaction+to+infection+by+Alternaria+brassicicola.">Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola.</a> J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).</li><li>Kline, R. M., Golab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+in+developing+thin-layer+bioautographs.">A simple technique in developing thin-layer bioautographs.</a> J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).</li><li>Wedge, D. E., Nagle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens.">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).</li><li>Beck, A. B., Knox, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acylated+isoflavone+glycosides+from+subterranean+clover+and+red+clover.">The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover.</a> Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).</li><li>Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., M&#248;ller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+reconstitution+of+cytochrome+P450ox+and+in+vitro+reconstitution+of+the+entire+biosynthetic+pathway+of+the+cyanogenic+glucoside+dhurrin+from+sorghum.">Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum.</a> Plant Physiol. 115 (4), (1997).</li><li>Peterson, C. A., Edgington, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+the+fungicide+benomyl+using+a+bioautograph+technique.">Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique.</a> J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het scheiden van een extract in deelverzamelingen van verbindingen en het testen van de subsets door contact bioautografie. De methode is vrij gelijkaardig aan degene die door Chomnawang et al.. 15 voor het screenen op plantenmetabolieten remmende to-gonorroe-veroorzakende bacteriën. Het type bioautografie gebruikt om het scherm voor antimicrobiële plantaardige stoffen hangt af van vele factoren, waaronder de test micro-organisme, het laboratorium...

Testen op antimicrobiële verbindingen in planten vereist het scheiden van de componenten van een plantenextract, blootstellen test micro-organisme die delen, en het bepalen of groei van het micro-organisme wordt geremd door een van de verbindingen. Scheidingen door papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC) zijn handig omdat veel verbindingen kunnen worden gescheiden op een vlak oppervlak. Scheiding is gebaseerd op polariteit met sommige verbindingen binden stevig aan het adsorptiemiddel (cellulose bij pc, en een verscheidenheid van adsorptiemiddelen bij TLC) en het migreren van minder dan anderen 1. Figuur 1 geeft een voorbeeld van de relatieve posities van polaire en niet-polaire fenolen na scheiding op een silica TLC-plaat. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" /> Figuur 1. Diagram verdelingen van verbindingen met verschillende polariteit na scheiding op een silica dunne-laagchromatografie (TLC) plaat. Fenolverbindingen rode klaver (Trifolium pratense L.) dienen als voorbeeld. Polaire verbindingen, zoals clovamide, een sterke affiniteit voor een polair adsorptiemiddel zoals silica en blijft bij de oorsprong (OR), terwijl minder polaire verbindingen, zoals de drie isoflavonen bij vloeistoffront (SF), verdeling gemakkelijker in de oplosmiddelen (die minder polair dan silica tenzij water, zuren, basen of zijn opgenomen) en migreren verder de plaat. Na afscheiding van een extract op een TLC-plaat kunnen micro-organismen in worden blootgesteld aan verbindingen op de plaat, waardoor sneller de identificatie van de actieve componenten van een extract 2. Als een schimmel of bacteriële kweek wordt blootgesteld aan het chromatogram zal microbiële groei overal optreden behalve dan gebieden met groei-inhibitory verbindingen. Remmingszones dan kan worden gevisualiseerd door het observeren van het contrast tussen myceliumgroei en de groei gebieden als fungi zijn aangebracht 3 of door besproeien met verbindingen die van kleur veranderen wanneer verminderd of gehydrolyseerd door levende cellen 4. Hoewel het gebruik van papier of dunne-laag chromatogrammen antimicrobiële assays eerst werd op 5 antibiotica en fungiciden 3,6 worden plantenextracten nu regelmatig onderzocht op antimicrobiële samenstellingen met deze werkwijze vaak aangeduid als bioautografie. De hierin beschreven protocollen toepassing bioautografie dunne-laag chromatogrammen. TLC wordt veel gebruikt omdat het relatief snel en kan worden uitgevoerd op verschillende adsorptiemiddelen (bijvoorbeeld silica, zetmeel, aluminiumoxide), alsmede het verschaffen van goede resolutie en gevoeligheid 1. Plantenextracten kunnen worden voorbereid TLC op vele manieren. Voorkomende methodes zijn extraheren plantmateriaal in alcohol-watermengsel zoals 80% ethanol 7,8, eventueel met toevoeging van zuur of base 9. Na een extractie dergelijke oplosmiddelen, die wat water bevatten en eventueel zure of basische moet extracten worden geconcentreerd zodat ze kunnen worden toegepast op TLC platen in een minimaal volume. De concentratie van alcohol-water extracten worden bereikt door het verdelen van met water mengbare organische oplosmiddelen 8 of een mengsel van dergelijke oplosmiddelen, zoals ethylacetaat-ethylether (1:1, v / v) 10,11. Verschillende plantmetabolieten worden geëxtraheerd in verschillende organische oplosmiddelen, afhankelijk van de polariteit. Om plantaardige organische zuren of basen worden geëxtraheerd in organische oplosmiddelen in dit stadium kan de pH van een alcohol-water extract worden verhoogd of verlaagd met een in water oplosbare zuur of base aan gedissocieerde analyten zetten in hun nondissociated vormen, die vervolgens oplosbaar in neutraal organische oplosmiddelen 9. De organische fase kan dan worden evaporated onder verminderde druk of onder stikstof en op de gewenste volume TLC. De pH van het extract waarschijnlijk dodelijk bioassay microorganismen door de verdeling van analyten in neutrale oplosmiddelen, kleine eindvolume en indampen van het extract op de TLC plaat vóór scheiding zijn. Zowel schimmels en bacteriën werkzaam zijn als proef micro-organismen in bioautografie van plantenextracten 2. Sporen van sommige schimmels, zoals Cladosporium cucumerinum ontkiemen op TLC-platen (met uitzondering van gebieden met remmende verbindingen) of gesproeid op platen in een voedingsoplossing en geïncubeerd in een vochtige omgeving voor meerdere dagen 3. De donkere mycelium van C. cucumerinum op non-inhibitive zones zorgt voor een scherp contrast met zones vrij van myceliumgroei. Hoewel bacteriën zijn toegepast op dunnelaagchromatografie (TLC) platen op dezelfde wijze 4,12, zijn bacteriën ook uitgegoten over TLCplaat oppervlakken in agar overlays 13,14. Gist zoals Candida albicans, kunnen worden toegepast agar overlays en 14. Als alternatief TLC-platen kan worden gezicht naar beneden geplaatst op agar geënt met bacteriën 10,15 of gist 8, een methode die bekend staat als contact bioautografie 2. We beschrijven een methode voor contact bioautografie om te screenen op antimicrobiële fenolen uit rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland). De test micro-organisme Clostridium sticklandii, een pens hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) en obligaat anaërobe. Hoewel de scheidingen die niet alle componenten van het extract lossen, vergemakkelijken ze de identificatie van gebieden van antimicrobiële activiteit, waardoor het verkleinen van de pool van mogelijke antimicrobiële verbindingen. Het protocol maakt gebruik van standaardprocedures voor TLC 1. Het protocol beschrijft ook een aantal van de technieken die nodig zijn voor het kweken obligate anaeroben voor een dergelijke test, een gebruik van contact bioautografie 15 en een visualisatie methode met een tetrazoliumzout, die levende cellen 2,4 vlekken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="739">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 &#215; 20 cm</td>
			<td>EMD Chemicals&#160;</td>
			<td>5554/7</td>
			<td>These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm.&#160; Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background.&#160; Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka.&#160; Adsorbents other than silica may be needed.&#160; Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp, heavy-duty scissors&#160;</td>
			<td>any sewing supply company</td>
			<td>similar to Fiskars&#160; 175800-1002</td>
			<td>For cutting TLC plates.&#160; A paper cutter with a sharp blade can be used as well.&#160; Do not inhale silica dust.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven at 100 &#176;C (mechanical convection)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225M</td>
			<td>Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Kimble Chase&#160;</td>
			<td>416180-0000</td>
			<td>Alternative sources:&#160; Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 &#215; 10 cm).&#160; Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-&#181;L syringe with flat needle tip</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td>For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 &#181;L.&#160; Alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipets</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-001</td>
			<td>For loading small amounts of standards or samples.&#160; Alternative sources:&#160; VWR.&#160; Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (#1 grade)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 917</td>
			<td>Serves as a chamber wick.&#160; Other grades of filter paper are OK.&#160; This size can be trimmed for the chambers holding 20 &#215; 20 cm plates.&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker tongs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-186</td>
			<td>For putting plates in and out of a large TLC chamber.&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-edge forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td>For putting plates in and out of a small chamber.&#160;&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively)</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>95-0271-01</td>
			<td>Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>Chromato-Vue C-10E</td>
			<td>UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here.&#160; Alternate sources: Spectronics Corporation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp</td>
			<td>Kodak&#160;</td>
			<td>Gel Logic 200</td>
			<td>&#160;Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com).&#160; See protocol for homemade alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl</td>
			<td>Coy&#160;</td>
			<td>7150000</td>
			<td>This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. &#160;However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay.&#160; A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ingredients for HAB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine &#183; 2 HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9380</td>
			<td>For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium D-Pantothenate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride &#183; 4 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypticase (Pancreatic digest of casein)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B11921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium carbonate &#183; H2O&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50841063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate &#183; 6 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>19464780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thin-layer chromatographic (tlc) separations and bioassays of plant extracts to identify antimicrobial compounds

Een gemeenschappelijke scherm plantaardige antimicrobiële verbindingen bestaat uit het scheiden plantaardige extracten van papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC), waardoor de chromatogrammen microbiële suspensies (bijv. schimmels of bacteriën in bouillon of agar), waarbij tijd voor de microben groeien een vochtige omgeving, en visualiseren zones zonder microbiële groei. De doeltreffendheid van deze screening methode bekend als bioautografie, afhankelijk van de kwaliteit van de chromatografische scheiding en de zorgvuldigheid microbiële kweekomstandigheden. Dit artikel beschrijft standaardprotocollen voor TLC en contact bioautografie met een nieuwe toepassing om-zuur gistende bacteriën aminozuren. Het extract wordt afgescheiden in flexibele (aluminium omlijsting) silica TLC-platen en banden gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht. Zones zijn uitgesneden en gedurende de voorkant omlaag op agar geënt met de test micro-organisme. Remmende banden worden gevisualiseerd door kleuring van de agar plaats met tetrazolium rood. De methode wordt toegepast op de scheiding van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) fenolen en hun screening op activiteit tegen Clostridium sticklandii, een hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) die is afkomstig uit de runder pens. De TLC methoden toepassen op vele soorten plantenextracten en andere bacteriesoorten (aëroob of anaëroob), evenals schimmels, kan worden gebruikt als testorganismen als cultuuromstandigheden worden aangepast aan de groeivereisten van de soort passen.

Vertegenwoordiger silica TLC scheidingen van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) extracten, het bevat fenolische verbindingen, zijn weergegeven in figuur 2. Scheiding van rode klaver extract in ethylacetaat-hexaan (9:1, v / v), meer dan 8,5 cm, resulteerde in vijf banden, een onvolledig gescheiden van de oorsprong (Figuur 2A). Echter, Figuur 2B toont aan dat ongeveer tweemaal zoveel banden werden onthuld wanneer een ander monster van rode klaver extrac...

Watch this Scientific Journal Video about Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds at JoVE.com

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

Methoden worden beschreven voor dunne-laag chromatografie (TLC) scheiding van plantenextracten en contact bioautografie antibacteriële metabolieten te identificeren. De methoden worden toegepast op de screening van rode klaver fenolen remmen hyper-ammoniak-producerende bacteriën (HAB) thuishoren in de runder pens.

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Analysis of Volatile and Oxidation Sensitive Compounds Using a Cold Inlet System and Electron Impact Mass Spectrometry

Analyse van vluchtige en oxidatie gevoelige verbindingen met behulp van een Cold Inlaat Systeem en Electron Impact Massaspectrometrie

This video presents a protocol for the mass spectrometrical analysis of volatile and oxidation sensitive compounds using electron impact ionization. The ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

On-line Analysis of Nitrogen Containing Compounds in Complex Hydrocarbon Matrixes

On-line analyse van stikstofhoudende verbindingen in Complex Hydrocarbon Matrix

The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Met behulp van capillaire elektroforese te kwantificeren organische zuren uit Plant Tissue: A Case Test Onderzoeken<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Zaden

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Synthesis of Plant Phenol-derived Polymeric Dyes for Direct or Mordant-based Hair Dyeing

Synthese van Plant Fenol-afgeleide Polymeer Kleurstoffen voor directe of Mordant-gebaseerde verven Hair

Effective hair dyeing through in situ incubation of keratin hair with the products of fungal laccase-catalyzed polymerization of plant phenols has been ...

Raman and IR Spectroelectrochemical Methods as Tools to Analyze Conjugated Organic Compounds

Raman en IR Spectroelectrochemical methoden als hulpmiddelen voor het analyseren van geconjugeerd organische stoffen

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule ...

Using Cyclic Voltammetry, UV-Vis-NIR, and EPR Spectroelectrochemistry to Analyze Organic Compounds

Met behulp van cyclische voltammetrie, UV-Vis-NIR en EPR Spectroelectrochemistry voor het analyseren van organische verbindingen

Cyclic voltammetry (CV) is a technique used in the analysis of organic compounds. When this technique is combined with electron paramagnetic resonance ...

Electrophoretic Crystallization of Ultrathin High-performance Metal-organic Framework Membranes

Elektroforetische kristallisatie van ultradunne High-performance metaal-organische kader membranen

We report the synthesis of thin, highly intergrown, polycrystalline metal-organic framework (MOF) membranes on a wide range of unmodified porous and ...