Name: thin-layer chromatographic (tlc) separations and bioassays of plant extracts to identify antimicrobial compounds
Uploaded: 2014-03-27T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds at JoVE.com

Damos las gracias al difunto Dr. Norma Taylor, Dept. Vegetal y Edafología de la Universidad de Kentucky, por permitirnos usar muestras de sus parcelas de trébol rojo para este estudio. Este proyecto fue financiado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.

1. Preparación del extracto de la planta <ol><li> Ver Kagan y Flythe 10 para la extracción de compuestos fenólicos de cv Trifolium pratense. Kenland. </li><li> Para extraer otros compuestos en otras plantas, comprobar la literatura análisis fitoquímico para los métodos de extracción de plantas-o-metabolitos específicos (muchos se describen), o buscar protocolos tales como los de Khurram et al. 7,8 que aíslan muchos compuestos con una amplia gama de polaridades. </li></o...

<ol>
	<li>Stahl, E., Ashworth, M. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thin-layer chromatography. , (1969).</li><li>Marston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+with+biological+detection+in+phytochemistry.">Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 .</li><li>Homans, A. L., Fuchs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bioautography+on+thin-layer+chromatograms+as+a+method+for+detecting+fungitoxic+substances.">Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances.</a> J. Chromatogr. 51, 327-329 .</li><li>Lund, B. M., Lyon, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+inhibitors+of+Erwinia+carotovora+and+E.+herbicola+on+thin-layer+chromatograms.">Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms.</a> J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).</li><li>Betina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioautography+in+paper+and+thin-layer+chromatography+and+its+scope+in+the+antibiotic+field.">Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field.</a> J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).</li><li>Weltzien, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ein+biologischer+Test+f&#252;r+fungizide+Substanzen+auf+dem+Papierchromatogramm.">Ein biologischer Test f&#252;r fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm.</a> Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).</li><li>Khurram, M., Khan, A. 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Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).</li><li>Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Organic Constituents of Higher Plants. , (1963).</li><li>Kagan, I. A., Flythe, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+separation+and+bioactivity+of+red+clover+(Trifolium+pratense)+extracts+assayed+against+Clostridium+sticklandii,+a+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium.">Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium.</a> Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).</li><li>Mattila, P., Kumpulainen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+and+total+phenolic+acids+in+plant-derived+foods+by+HPLC+with+diode-array+detection.">Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection.</a> J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).</li><li>Hamburger, M. O., Cordell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+bioautographic+TLC+assay+for+compounds+possessing+antibacterial+activity.">A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity.</a> J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).</li><li>Flythe, M., Kagan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+effect+of+red+clover+(Trifolium+pratense)+phenolic+extract+on+the+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium,+Clostridium+sticklandii.">Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii.</a> Curr. Microbiol. 61, 125-131 .</li><li>Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioautographic+agar+overlay+method+for+the+detection+of+antifungal+compounds+from+higher+plants.">A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants.</a> Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).</li><li>Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antigonococcal+activity+of+Coscinium+fenestratum+stem+extract.">In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract.</a> J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).</li><li>Stahl, E., Kaldewey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spurenanalyse+physiologisch+aktiver,+einfacher+Indolderivate.">Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate.</a> Hoppe-Seyler&#8217;s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 .</li><li>Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ecotype+variability+in+camalexin+production+and+reaction+to+infection+by+Alternaria+brassicicola.">Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola.</a> J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).</li><li>Kline, R. M., Golab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+in+developing+thin-layer+bioautographs.">A simple technique in developing thin-layer bioautographs.</a> J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).</li><li>Wedge, D. E., Nagle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens.">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).</li><li>Beck, A. B., Knox, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acylated+isoflavone+glycosides+from+subterranean+clover+and+red+clover.">The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover.</a> Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).</li><li>Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., M&#248;ller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+reconstitution+of+cytochrome+P450ox+and+in+vitro+reconstitution+of+the+entire+biosynthetic+pathway+of+the+cyanogenic+glucoside+dhurrin+from+sorghum.">Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum.</a> Plant Physiol. 115 (4), (1997).</li><li>Peterson, C. A., Edgington, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+the+fungicide+benomyl+using+a+bioautograph+technique.">Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique.</a> J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).</li></ol>

Este protocolo describe un método sencillo para la separación de un extracto en subconjuntos de compuestos y ensayando esos subconjuntos por contacto bioautografía. El método es bastante similar a uno utilizado por Chomnawang et al. 15 para la detección de metabolitos vegetales inhibitorios para las bacterias que causan la gonorrea. El tipo de bioautografía empleado para la detección de compuestos antimicrobianos de plantas depende de muchos factores, incluyendo el microorganismo de ensayo, la...

El ensayo para compuestos antimicrobianos en las plantas requiere la separación de los componentes de un extracto de la planta, la exposición de un microorganismo de ensayo a los componentes, y la determinación de si el crecimiento del microorganismo es inhibido por cualquiera de los compuestos. Separaciones por papel o la cromatografía en capa fina (PC o TLC) son convenientes porque muchos compuestos pueden ser separados en una superficie plana. La separación se basa en la polaridad, con algunos compuestos que se unen fuertemente al adsorbente (celulosa en el caso de la PC, y una variedad de adsorbentes en el caso de TLC) y la migración de menos que otros 1. La Figura 1 proporciona un ejemplo de las posiciones relativas de compuestos fenólicos polares y no polares después de separación en una placa de TLC de sílice. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama que ilustra las distribuciones de compuestos de diferentes polaridades después de separación en una capa fina de sílice para cromatografía (TLC) placa. Compuestos fenólicos de trébol rojo (Trifolium pratense L.) se utilizan como un ejemplo. Los compuestos polares, tales como clovamide, tienen una fuerte afinidad por un adsorbente polar como sílice y permanecen cerca del origen (O), mientras que los compuestos polares menos, tales como las tres isoflavonas cerca de la frente del disolvente (SF), partición más fácilmente en los disolventes (que son menos polares que a menos que la sílice se incluyen agua, ácidos o bases) y migrar más arriba de la placa. Después de la separación de un extracto en una placa de TLC, microorganismos de prueba pueden estar expuestos a todos los compuestos en la placa, acelerando así la identificación de los componentes activos de un extracto 2. Si un cultivo fúngico o bacteriano se expone a la cromatograma, el crecimiento microbiano se producirá en todas partes excepto en áreas con crecimiento-inhibidorcompuestos y. Las zonas de inhibición a continuación, se pueden visualizar mediante la observación del contraste entre el crecimiento del micelio y las áreas de crecimiento libre de hongos si se han aplicado 3 o por pulverización con compuestos que cambian de color cuando se reduce o hidrolizado por las células vivas 4. Aunque el uso de papel o de capa fina cromatogramas para los ensayos antimicrobianos se aplicó primero a los antibióticos y fungicidas 5 3,6, extractos de plantas ahora son analizados con frecuencia para los compuestos antimicrobianos con este método, a menudo referido como bioautografía. Los protocolos descritos en el presente documento se aplican a bioautografía de los cromatogramas de capa fina. TLC se utiliza ampliamente debido a que es relativamente rápida y se puede realizar en diferentes adsorbentes (por ejemplo, sílice, almidón, alúmina), así como proporcionando buena resolución y sensibilidad 1. Los extractos de plantas se pueden preparar para TLC de muchas maneras. Los métodos comunes incluyen material vegetal de extracción en alcmezclas ohol-agua tales como etanol al 80% 7,8, posiblemente con la adición de ácido o base 9. Después de una extracción en tales disolventes, que contienen un poco de agua y son, posiblemente, ácido o básico, extractos deben concentrarse de manera que puedan ser aplicadas a placas de TLC en un volumen mínimo. La concentración de los extractos de alcohol-agua se puede lograr mediante la partición con disolventes orgánicos inmiscibles en agua 8 o con una mezcla de tales disolventes, tales como acetato de acetato de etilo-éter (1:1, v / v) 10,11. Diferentes metabolitos vegetales se extraen en diferentes disolventes orgánicos, dependiendo de sus polaridades. Para garantizar que los ácidos o bases orgánicos vegetales se extraen en disolventes orgánicos en esta etapa, el pH de un extracto de alcohol y agua se puede subir o bajar con un ácido o base soluble en agua para convertir los analitos disociadas en sus formas no disociada, que luego se soluble en disolventes orgánicos neutros 9. La fase orgánica puede entonces ser correovaporated bajo presión reducida o en atmósfera de nitrógeno y se ajustó hasta el volumen deseado para TLC. El pH del extracto es poco probable que sea letal para microorganismos de bioensayo debido a la compartimentación de los analitos en disolventes neutros, pequeño volumen final, y la evaporación del extracto sobre la placa de TLC antes de la separación. Ambos hongos y bacterias se emplean como microorganismos de prueba en bioautografía de extractos de plantas 2. Las esporas de algunos hongos, tales como Cladosporium cucumerinum, germinan en placas de TLC (aparte de las zonas con compuestos inhibidores) si se pulveriza sobre las placas en una solución nutriente y se incubaron en un ambiente húmedo durante varios días 3. El micelio oscuro de la C. cucumerinum en zonas no inhibidor proporciona un fuerte contraste con las zonas francas de crecimiento del micelio. Aunque las bacterias se han aplicado a cromatografía en capa fina (TLC) placas de la misma manera 4,12, las bacterias también se vierten sobre TLCsuperficies de las placas de agar se superpone a 13,14. Levaduras, tales como Candida albicans, se puede aplicar en las capas de agar, así 14. Alternativamente, las placas de TLC se pueden colocar boca abajo en agar inoculado con bacterias o levaduras 10,15 8, un método conocido como el contacto bioautografía 2. Se describe un método para el contacto bioautografía para la detección de compuestos fenólicos antimicrobianos a partir de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland). El microorganismo de ensayo es Clostridium sticklandii, un hiper bacteria productora de amoníaco ruminal (HAB) y obligar anaerobio. Aunque las separaciones utilizadas no resuelven todos los componentes del extracto, facilitan la identificación de las zonas de actividad antimicrobiana, reduciendo de este modo el conjunto de posibles compuestos antimicrobianos. El protocolo utiliza procedimientos estándar para TLC 1. El protocolo también describe algunas de las técnicas necesarias para obli cultivoanaerobios puerta de dicho ensayo, el uso de contactos bioautografía 15 y un método de visualización con una sal de tetrazolio, que tiñe las células vivas 2,4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="739">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 &#215; 20 cm</td>
			<td>EMD Chemicals&#160;</td>
			<td>5554/7</td>
			<td>These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm.&#160; Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background.&#160; Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka.&#160; Adsorbents other than silica may be needed.&#160; Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp, heavy-duty scissors&#160;</td>
			<td>any sewing supply company</td>
			<td>similar to Fiskars&#160; 175800-1002</td>
			<td>For cutting TLC plates.&#160; A paper cutter with a sharp blade can be used as well.&#160; Do not inhale silica dust.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying oven at 100 &#176;C (mechanical convection)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PR305225M</td>
			<td>Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC chamber</td>
			<td>Kimble Chase&#160;</td>
			<td>416180-0000</td>
			<td>Alternative sources:&#160; Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 &#215; 10 cm).&#160; Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-&#181;L syringe with flat needle tip</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td>For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 &#181;L.&#160; Alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipets</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-001</td>
			<td>For loading small amounts of standards or samples.&#160; Alternative sources:&#160; VWR.&#160; Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper (#1 grade)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 917</td>
			<td>Serves as a chamber wick.&#160; Other grades of filter paper are OK.&#160; This size can be trimmed for the chambers holding 20 &#215; 20 cm plates.&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker tongs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-186</td>
			<td>For putting plates in and out of a large TLC chamber.&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-edge forceps&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
			<td>For putting plates in and out of a small chamber.&#160;&#160; Alternate sources: VWR&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively)</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>95-0271-01</td>
			<td>Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp</td>
			<td>Ultraviolet Products&#160;</td>
			<td>Chromato-Vue C-10E</td>
			<td>UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here.&#160; Alternate sources: Spectronics Corporation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp</td>
			<td>Kodak&#160;</td>
			<td>Gel Logic 200</td>
			<td>&#160;Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com).&#160; See protocol for homemade alternative.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl</td>
			<td>Coy&#160;</td>
			<td>7150000</td>
			<td>This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described. &#160;However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay.&#160; A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8877</td>
			<td>Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ingredients for HAB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxamine &#183; 2 HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9380</td>
			<td>For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Riboflavin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium D-Pantothenate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipoic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Aminobenzoic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalamine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxal HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridoxine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate &#183; 7 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride &#183; 4 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;C8661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride &#183; 6 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium molybdate &#183; 2 H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>331058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypticase (Pancreatic digest of casein)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>B11921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium carbonate &#183; H2O&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>50841063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate &#183; 6 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride &#183; 2 H2O</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteine HCl</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>19464780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thin-layer chromatographic (tlc) separations and bioassays of plant extracts to identify antimicrobial compounds

Una pantalla común para los compuestos antimicrobianos de plantas consiste en la separación de extractos de plantas por papel o cromatografía en capa fina (PC o TLC), la exposición de los cromatogramas a las suspensiones microbianas (por ejemplo hongos o bacterias en caldo o agar), dejando tiempo para que los microbios para crecer en un ambiente húmedo, y la visualización de zonas sin crecimiento microbiano. La eficacia de este método de detección, conocido como bioautografía, depende tanto de la calidad de la separación cromatográfica y el cuidado con las condiciones de cultivo microbianos. Este artículo describe los protocolos estándar para TLC y el contacto bioautografía con una novedosa aplicación a los amino ácidos bacterias que fermentan. El extracto se separa en (aluminio con respaldo) placas de TLC de sílice flexibles, y las bandas se visualizaron bajo luz ultravioleta (UV). Las zonas se cortaron y se incubaron boca abajo en agar inoculado con el microorganismo de ensayo. Bandas inhibidoras se visualizaron por tinción de la placa de agars con tetrazolio rojo. El método se aplica a la separación de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland) compuestos fenólicos y su programación para la actividad contra Clostridium sticklandii, una bacteria productora de amoníaco hiper (HAB) que es nativa al rumen bovino. Los métodos de TLC se aplican a muchos tipos de extractos de plantas y otras especies bacterianas (aeróbicas o anaeróbicas), así como hongos, pueden ser utilizados como organismos de prueba si las condiciones de cultivo se modifican para adaptarse a los requisitos de crecimiento de las especies.

Representante separaciones TLC de sílice de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland) extractos, que contienen compuestos fenólicos, se muestran en la Figura 2. Separación de extracto de trébol rojo en acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), más de 8,5 cm, dio lugar a cinco bandas, una forma incompleta resuelto desde el origen (Figura 2A). Sin embargo, la Figura 2B demuestra que alrededor del doble de las bandas fueron reveladas cuando una muestra difere...

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Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Cromatográfico en capa fina (TLC) Separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos

Se describen procedimientos para cromatografía en capa fina (TLC) separación de extractos de plantas y el contacto bioautografía para identificar metabolitos antibacterianos. Los métodos se aplican a la selección de compuestos fenólicos de trébol rojo que inhiben las bacterias productoras de amoniaco hiper (HAB) nativas para el rumen bovino.

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Investigación

Química

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

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Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

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La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

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The shift to heavy crude oils and the use of alternative fossil resources such as shale oil are a challenge for the petrochemical industry. The ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

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Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semillas

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Synthesis of Plant Phenol-derived Polymeric Dyes for Direct or Mordant-based Hair Dyeing

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Usando voltametría cíclica, UV-Vis-NIR y EPR Spectroelectrochemistry para analizar compuestos orgánicos

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