Name: monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

نشكر اليخاندرو برون من CISA-INIA لتوفير المضادة للفيروس حمى الوادي المتصدع الأمصال. ويدعم العمل في المختبرات لدينا من قبل Forschungsförderung الأحجار الكريمة. § 2 عبس. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum غيسن اوند ماربورغ، وكلية الدراسات العليا لايبنتز للالناشئة الأمراض الفيروسية (EIDIS)، وDFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021، وDFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. البذر من خلايا A549 للعدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة قارورة T75 الخلايا A549 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في خلية ثقافة المتوسط ​​(DMEM تستكمل مع FCS 10٪، 526.6 ملغم / لتر L-الجلوتامين، 50.000 U / البنسلين لتر، و 50 ملغ / لتر الستربتوميسين). </li><li style=";text-align...

الاستشعار عن وجود فيروسات وتفعيل نوع المضادة للفيروسات أنا الإنترفيرون النظام هي حاسمة لنجاح الاستجابات المناعية الفطرية 22. وبالتالي بوساطة الكشف عن الفيروس عن طريق المستقبلات الاعتراف الممرض (خنازير) مثل RIG-I وPKR، مما يتيح استجابة سريعة وتفعيل آليات الدفاع ال...

A حدثا هاما في الدفاع المضيف المضادة للفيروسات هو الكشف السريع عن مسببات المرض عن طريق ما يسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 1،2. الكشف عن الخلايا من عدوى فيروس الحمض النووي الريبي يعتمد على اثنين من helicases الحمض النووي الريبي حشوية، RIG-I (حمض الريتينويك الجينات محرض I) وMDA5 (ميلانوما التمايز بروتين يرتبط 5) 3-5. ويتكون RIG-I اثنين من المجالات N-محطة التوظيف كاسباس (بطاقات)، وهو نوع المركزية دتش مربع RNA helicase المجال، ومجال-C محطة (CTD) 4،6. في حين يطلب من CTD والمجال helicase للاعتراف غير المتمتعة بالحكم الذاتي (الفيروسية) الرنا، وبطاقات توسط إشارات المصب مما يؤدي إلى إنشاء حالة المضيف المضادة للفيروسات. إذا RIG-I في حالة صامتة، أي في حالة عدم وجود الحمض النووي الريبي يجند محددة، يتفاعل البطاقة الثانية مع المجال helicase المركزية ويحتفظ RIG-I في السيارات المثبطة التشكل 7-11. RIG-I بربط قصيرة المزدوجحبلا (س) RNA تحمل 5&#39;-ثلاثي الفوسفات (5&#39;PPP)، طويلة الرنا المزدوج الجديلة، والجيش الملكي النيبالي polyU / UC-الغنية، والهياكل التوقيع الكلاسيكية التي هي موجودة على الجينوم من العديد من الفيروسات RNA 12-16. اثنين من الخصائص الرئيسية لتفعيل RIG-I هي التحول إلى التشكل مغلقة 6،17 وهومو oligomerization 6،18،19. مفتاح بتكوين يعزز الحمض النووي الريبي ملزمة، يعرض بطاقات للإشارات المصب، وreconstitutes موقع أتباز نشطة 8،9،11،20. تشكيل المجمعات RIG-I من oligomeric يؤدي إلى تعزيز توظيف المصب جزيئات محول الإشارات لتشكيل منبر للفيروسات نقل الإشارة 11. سلسلة إشارات RIG-I-تنظيم ينشط في نهاية المطاف عامل النسخ IRF-3 لمدة تصل التنظيم من الانترفيرون (IFN-alpha/beta) الجينات وبالتالي التعبير الجيني للفيروسات حفزت الجينات (ISGS) للاستجابة للفيروسات الكامل 21،22 . واحدة من أفضل ISGS تتميز البروتينات هو تنشيط الحمض النووي الريبين كيناز (PKR) 23. PKR ينتمي إلى عائلة حقيقية النواة ترجمة الشروع عامل ألفا 2 (eIF2α) تحركات ويتكون من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي ملزمة المجال-N محطة وكيناز C نطاق المحطة. يشكل المجال كيناز واجهة dimerization حاسمة لتفعيل PKR وينفذ وظائف الحفاز للبروتين. ملزمة من PKR لالرنا المزدوج الجديلة الفيروسية يؤدي إلى تغيير موقفها والسماح بتكوين dimerization وصناعة السيارات في الفسفرة في الثريونين 446 بين المخلفات الأخرى. PKR ثم يتوسط الفسفرة من eIF2α، وبالتالي عرقلة ترجمة الفيروسية mRNAs و23-27. كلا RIG-I وPKR الخضوع لإعادة ترتيب هيكلية رئيسية، شكل مجمعات من oligomeric وتكون بعد translationally تعديلها من قبل الفسفرة / نزع الفسفات وubiquitination 10،11،19،23،24،26-29. من أجل فهم أفضل منها هياكل الحمض النووي الريبي الفيروسي يتم تفعيل RIG-I وPKR (وفي أي مرحلة مضادات فيروسية يمكن أن به التدخل)، من المهم أن تحدد بدقة حالة التنشيط. لكل من خنازير تم وصفها سابقا أن التنشيط يؤدي إلى ظهور مقاومة للشظايا البروتين التربسين 6،17،30 والعليا الأوليغومرات 6،18،19. ومع ذلك، وبالنظر إلى ثروة من الأدب على هذه العوامل الرئيسية للاستجابة للفيروسات المضيف 1،2،24، وتطبيق أساليب مباشرة يبدو نادرة نسبيا. أملا في تحفيز استخدام أوسع، ونحن نقدم بروتوكولات مريحة وحساسة لتحليل بقوة الدول تفعيل RIG-I وPKR. إصابة الإنترفيرون المختصة خط الخلية البشرية A549 مع المنشط أنشئت من RIG-I وPKR، والموهن فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13) 31،32. بعد إجراء lysing بسيطة، يتم اختبار مقتطفات من الخلايا المصابة بواسطة محدودة التربسين الهضم / تحليل لطخة غربية لتقييم التحول متعلق بتكوين جزئي، والأزرق الأصلي هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) / analys طخة غربيةهو قياس تشكيل الأوليغومرات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

دفاعات المضيف لعدوى فيروس تعتمد على الكشف السريع عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) من نظام المناعة الفطري. في السيتوبلازم، وخنازير RIG-I وPKR ربط إلى بروابط محددة RNA الفيروسي. هذا يتوسط أول تبديل متعلق بتكوين وoligomerization، ومن ثم تمكن من تفعيل استجابة للفيروسات المضادة للفيروسات. في حين وضعت أساليب لقياس التعبير الجيني للفيروسات المضيف بشكل جيد، وأساليب لمراقبة مباشرة للدول تفعيل RIG-I وPKR هي إلا جزئيا وأقل راسخة. هنا، نحن تصف طريقتين لرصد RIG-I وPKR التحفيز على العدوى مع محفز مضاد للفيروسات المعمول بها، فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13). محدودة التربسين الهضم يسمح لتحليل التغيرات في حساسية الأنزيم البروتيني، مشيرا إلى التغييرات متعلق بتكوين جزئي للخنازير. التربسين هضم لست] من خلايا وهمية نتائج المصابة في التحلل السريع من RIG-I وPKR، whereaق الكلورين العدوى 13 يؤدي إلى ظهور مقاومة للالبروتيني RIG-I الجزء. أيضا PKR يظهر المقاومة التي يسببها فيروس جزئية لعملية الهضم التربسين، والذي يتزامن مع الفسفرة السمة المميزة لها في الثريونين 446. تشكيل RIG-I وجرى التحقق من الأوليغومرات PKR من قبل الأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). على العدوى، وهناك تراكم قوية من RIG-I والمجمعات من oligomeric PKR، في حين ظلت هذه البروتينات كما مونومرات في عينات المصابة وهمية. محدودة الهضم البروتيني وPAGE الأم، إلى جانب كل من لتحليل لطخة غربية، تسمح لقياس حساسية ومباشرة من خطوتين متنوعة من RIG-I وتفعيل PKR. هذه التقنيات هي سهلة نسبيا وسريعة لأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن.

الاعتراف ناهض الفيروسية من خلال سلفة-I أو مشغلات PKR تحويل متعلق بتكوين 6،17،30 6،18،27 وoligomerization. نحن يعاير هذه العلامات من قبل اثنين من تفعيل محدودة الهضم البروتيني والأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE)، على التوالي. أصيب الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

يتم تشغيل الدفاعات الفطرية للعدوى الفيروس عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير). وهما خنازير حشوية RIG-I وPKR ربط إلى الرنا الفيروسي التوقيع، وتغير التشكل، oligomerize، وتفعيل الإشارات المضادة للفيروسات. يتم وصف الأساليب التي تسمح لرصد ملائم تبديل متعلق بتكوين وoligomerization هذه خنازير حشوية.

تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

الاعتراف ناقلة الغلوتامين البشرة بواسطة الأجسام المضادة IgA و 2 ناقلة الغلوتامين الأنسجة في حالة نادرة من القرد الجلد

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

المناعي لمراقبة الخلوية امتصاص اللاكتوفيرين الإنسان ولها نشاط مضاد للفيروسات أسوشيتد ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

الإنزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والأنزيمات

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

الهضم الكبد مورين لتحليل تدفق سيتوميتريك اللمفاوية خلايا غشائي

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...