Name: monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00
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私たちは、反リフトバレー熱ウイルスの血清を提供するためのCISA-INIAからアレハンドロ·ブランに感謝します。私たちの研究室での作業はForschungsförderung宝石でサポートされています。 2腹筋を§。 3 KooperationsvertragUniversitätsklinikumギーセンウントマールブルグ、新興ウイルス性疾患のためのライプニッツ研究科（EIDIS）、DFG Sonderforschungsbereich（SFB）1021、およびDFG Schwerpunktprogramm（SPP）1596。

感染のA549細胞の1。シーディング<ol><li>細胞培養培地中でCO 2、37℃でA549細胞をT75フラスコを育成し、5％（DMEM、10％FCS、526.6ミリグラム/ lのL-グルタミン、50.000 U / lのペニシリン、および50mg / Lのストレプトマイシンを補充した）。 </li><li>細胞を回収し始める前に、37℃に加熱した水浴中で細胞培養培地、PBSおよび0.05％トリプシン-EDTAを温める</li><li>培地を除去し、10mlのPBSで細胞を洗?...

ウイルスや私は、システムをIFNの抗ウイルスタイプの活性化の存在を感知すると、成功した自然免疫応答22に重要である。ウイルス検出することにより迅速な応答および抗ウイルス防御機構の活性化を可能にする、RIG-IおよびPKRなどの病原体認識受容体（PRR）によって媒介される。ここでは、直接RIG-IおよびPKRの活性化状態を評価するために二つの方法を記載している。 <p class="jove_...

抗ウイルス宿主防御において重要な出来事は、いわゆるパターン認識受容体（PRR） の1,2による病原体の迅速な検出である。 RNAウイルス感染の細胞内検出は、2細胞質RNAヘリカーゼ、RIG-I（レチノイン酸誘導性遺伝子I）およびMDA5（メラノーマ分化関連タンパク質5）3-5に依存している。 RIG-Iは、2つのN-末端カスパーゼ動員ドメイン（カードなど）、中枢DECHボックス型RNAヘリカーゼドメイン、およびC末端ドメイン（CTD）4,6とから構成されている。 CTDおよびヘリカーゼドメインが非自己（ウイルス）RNAの認識に必要で​​あるのに対し、カードが抗ウイルスホストのステータスの確立につながる下流のシグナル伝達を仲介する。 RIG-Iが無音状態である場合、 すなわち、特定のRNAリガンドの非存在下で、第二のCARDは、中央ヘリカーゼドメインと相互作用し、自己阻害コンフォメーション7-11にRIG-Iを保つ。 RIG-Iは、短い二本に結合する5&#39;-三リン酸（5&#39;PPP）、長いdsRNA、およびポリU / UC豊富なRNA、多くのRNAウイルス12から16のゲノム上に存在する古典的な署名の構造を持つ鎖（DS）のRNA。 RIG-I活性化の二つの主要な特徴は、閉じたコンフォメー6,17およびホモオリゴマー6,18,19に切り替えている。コンフォメーションスイッチは、RNAが結合を増強下流のシグナル伝達のためのカードを公開し、活発なATPアーゼサイト8,9,11,20を再構成する。オリゴマーRIG-I複合体の形成は、抗ウイルスシグナル伝達のためのプラットフォーム11を形成するために、下流のシグナル伝達アダプター分子の増強された動員をもたらす。 RIG-I-調節されたシグナル伝達鎖は、最終的にアップレギュレーションインターフェロン（IFN-alpha/beta）遺伝子、完全な抗ウイルス応答21,22インターフェロン刺激遺伝子（ISGの）の、従って遺伝子発現のための転写因子IRF-3を活性化する。最も特徴ISGの一つは、RNA活性化proteiですNキナーゼ（PKR）23。 PKRは、真核生物翻訳開始因子2アルファ（eIF2αリン）キナーゼのファミリーに属し、N末端の二本鎖RNA結合ドメインおよびC-末端キナーゼドメインから構成される。キナーゼドメインは、PKR活性化のための二量体化界面が重要で構成しており、タンパク質の触媒機能を実行する。ウイルスのdsRNAのPKRの結合は、他の残基の間のThr 446で二量体化および自己リン酸化を可能にする、そのコンフォメーション変化をもたらす。 PKRは、それによってウイルスmRNA 23〜27の翻訳をブロックする、eIF2αリンのリン酸化を仲介する。 RIG-IおよびPKRの両方は、主要な構造再配列を受けるオリゴマー複合体を形成し、翻訳後リン酸化/脱リン酸化およびユビキチン化10,11,19,23,24,26-29によって修飾される。ウイルスのRNA構造がRIG-IおよびPKRを活性化している（どのような段階でウイルスのアンタゴニストをbの可能性がより良い理解のためにe）に干渉し、それは正確に活性化状態を決定することが重要である。両方のPRRのために、予め活性化は、トリプシン耐性タンパク質断片6,17,30及び高次オリゴマー6,18,19の出現をもたらすことが記載されている。しかし、抗ウイルス宿主応答1,2,24のこれらの重要な要因に関する文献が豊富に与えられ、直接法の適用は比較的まれと思われる。より広範な使用状況を刺激するのを期待し、我々は強固に、RIG-Iと、PKRの活性化状態を分析するために便利で敏感なプロトコルを提供する。 IFN有能なヒト細胞株A549は、RIG-IおよびPKR弱毒リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）31,32の確立された活性化因子に感染している。単純な溶解手順の後、感染細胞の抽出物は、コンホメーションのスイッチングを評価するために、制限されたトリプシン消化/ウェスタンブロット分析によって試験され、青色ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）/ウェスタンブロットによるanalysオリゴマーの形成を測定することである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

ウイルス感染に対する宿主防御は、自然免疫系のパターン認識受容体（PRR）による迅速な検出に依存している。細胞質内に、PRRは、RIG-IおよびPKRは、特定のウイルスRNAリガンドに結合する。これは、最初のコンホメーションのスイッチングおよびオリゴマー化を媒介し、その後、抗ウイルスインターフェロン応答の活性化を可能にします。抗ウイルス宿主遺伝子発現を測定するための方法は十分に確立されているが、直接、RIG-IおよびPKRの活性化状態をモニターする方法は、部分的にのみであり、以下で十分に確立。 ここでは、確立されたインターフェロン誘導剤、リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL 13）の感染の際に、RIG-IおよびPKR刺激を監視するために二つの方法を説明します。限られたトリプシン消化は、PRRはの立体構造変化を示す、プロテアーゼ感受性の変化を分析することができます。 RIG-IとPKR、whereaの急速な劣化を模擬感染細胞の結果から溶解物のトリプシン消化S Clで13感染はプロテアーゼ耐性RIG-I断片の出現につながる。また、PKRは、Thr 446で、その特徴的なリン酸化と一致し、トリプシン消化にウイルス誘導部分の抵抗を示している。RIG-IとPKRオリゴマーの形成は、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により検証された。これらのタンパク質は疑似感染サンプル中の単量体として残るのに対し、感染の際に、RIG-IとPKRのオリゴマー複合体の強力な蓄積がある。 限られたプロテアーゼ消化し、ネイティブPAGE、ウェスタンブロット分析に連結された両方が、RIG-IとPKR活性化の2多様な段階の感度で直接測定を可能にします。これらの技術は、実行するのが比較的容易かつ迅速であり、高価な装置を必要としない。

RIG-IまたはPKRによるウイルス薬の認識は、コンホメーションのスイッチング6,17,30およびオリゴマー6,18,27をトリガします。我々は、それぞれ、限られたプロテアーゼ消化およびネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）によって、これら二つの活性化マーカーをアッセイした。 ヒトA549細胞は、IFNアンタゴニストのNS 35,36の突然変異によ?...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

ウイルス感染に対する自然の防御はパターン認識受容体（PRR）によってトリガされます。ウイルスシグネチャのRNA、変更高次構造、オリゴマー化する2細胞質のPRR、RIG-IおよびPKRに結合し、抗ウイルスシグナル伝達を活性化する。方法は、都合のコンホメーションスイッチングと、これらの細胞質のPRRのオリゴマー化をモニタリングすることを可能にする記述されている。

抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

の稀なケースでIgAおよび組織トランスグルタミナーゼ2抗体による表皮トランスグルタミナーゼの認識アカゲザル炎

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

C型肝炎ウイルスに対するヒトラクトフェリンの細胞取り込みおよびそれに関連する抗ウイルス活性を監視するために、免疫蛍光

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

アルボ ウイルス感染症ウイルス免疫調節剤およびホスト抗ウイルス因子の同定のためのスクリーニング ツールとして

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

受容体と酵素間の機能的相互作用を研究するため Co 免疫沈降分析

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

二本鎖 RNA と否定的な感覚の RNA のウイルス感染におけるパターン認識受容体の共焦点レーザー顕微鏡

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...