Name: monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00
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우리는 안티 리프트 밸리 열병 바이러스의 혈청을 제공하는 CISA-INIA에서 알레한드로 브룬 감사합니다. 우리의 실험실에서 작업 Forschungsförderung 보석에 의해 지원됩니다. 2 상승률 §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum 기센 운트 마르부르크, 신흥 바이러스 성 질병에 대한 라이프니츠 대학원 (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 및 DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

감염 A549 세포의 1. 시드 <ol><li> 37 ° C에서 A549 세포의 T75 플라스크를 육성하고 5 %는 세포 배양 배지에서 CO 2 (DMEM 10 % FCS, 526.6 ㎎ / ℓ의 L-글루타민, 50.000 U / L 페니실린, 50 ㎎ / ℓ의 스트렙토 마이신과 보충). </li><li> 세포를 수확을 시작하기 전에 37 ℃로 가열 수조에 세포 배양 배지, PBS 0.05 % 트립신-EDTA를 따뜻하게 </li><li> 매체를 제거하고 10 ㎖의 PBS로 세포를 씻어. 다시 PBS를 제거합니다. <...

바이러스의 존재와 I 시스템을 IFN 항 바이러스 유형의 활성화를 감지 성공적으로 타고난 면역 반응 22 중요하다. 바이러스 탐지함으로써 신속한 대응 및 항 바이러스 방어 메커니즘의 활성화를 가능하게 RIG-I와 PKR 같은 병원체 인식 수용체 (PRRS)에 의해 매개된다. 여기, 우리가 직접 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 평가하기 위해 두 가지 방법을 설명합니다. RIG-I과 PKR의 구?...

항 바이러스 숙주 방어에서 중요한 이벤트는 소위 패턴 인식 수용체 (PRRS) 1,2에 의해 병원균의 신속한 검출입니다. RNA 바이러스 감염 세포 내 검출은 두 가지 세포 내 RNA의 헬리, RIG-I (레티노 산 유도 유전자 I) 및 MDA5 (흑색 종 분화 관련 단백질 5) 3-5에 따라 달라집니다. RIG-I은 두 개의 N-말단 카스파 모집 도메인 (카드), 중앙 DECH 박스 타입 RNA 헬리 케이즈 도메인과 C-말단 도메인 (CTD) 4,6로 구성되어있다. CTD 및 헬리 케이즈 도메인이 아닌 자기 (바이러스) RNA를 인식에 필요한 반면, 카드는 항 바이러스 호스트 상태의 설립에 이르는 다운 스트림 신호를 중재. RIG-I가 특정 RNA 리간드의 부재 즉 무음 상태에있는 경우, 제 CARD는 중앙 헬리 케이즈 도메인과 상호 작용하고 자동 억제 입체 7-11 RIG-I를 유지한다. RIG-I는 짧은에 바인딩 더블5&#39;-트리 포스페이트 (5&#39;PPP), 긴 dsRNA에, 그리고 polyU / UC 풍부한 RNA, 많은 RNA 바이러스 12-16의 게놈에 존재하는 고전적인 서명 구조 베어링 가닥 (DS) RNA. RIG-I 활성화의 두 가지 주요 특성은 닫힌 형태 6,17 및 호모 올리고머 6,18,19로 전환합니다. 구조적 스위치, RNA 바인딩 향상 다운 스트림 신호의 카드를 노출하고 활성 ATP 아제 사이트 8,9,11,20을 재구성한다. 올리고머 RIG-I 복합체의 형성은 항 바이러스 신호 전달 (11)를위한 플랫폼을 형성하도록 하류 시그널링 어댑터 분자의 향상된 모집에 이르게한다. RIG-I-조절 신호 체인은 결국 전사 인자를 활성화 IRF-3 위로 규칙 전체 바이러스 반응 (21, 22)에 대한 인터페론 (IFN-alpha/beta) 유전자와 인터페론 자극 유전자의 따라서 유전자 발현 (ISGs)의 . 최고의 특성화 ISGs 중 하나는 RNA 활성화 PROTEI입니다N 키나제 (PKR) 23. PKR은 진핵 번역 개시 인자 2 알파 (eIF2α) 키나아제의 가족에 속하는 N-말단 이중 가닥 RNA 결합 도메인과 C-말단 키나제 도메인으로 구성되어 있습니다. 키나아제는 PKR 활성화를위한 이량 인터페이스 중요한 구성하고 단백질의 촉매 기능을 수행한다. 바이러스를 dsRNA에 PKR의 바인딩의 구조적 변화가 다른 잔류 물 사이의 Thr 446에 이합체 및 자동 인산화를 허용로 연결됩니다. PKR는 따라서 바이러스의 mRNA 23-27의 번역을 차단 eIF2α의 인산화를 중재. RIG-I와 PKR 모두 주요 구조 재 배열을 받아야 올리고머 단지를 형성하고 포스트 병진 인산화 / 탈 인산화와 유비퀴틴 10,11,19,23,24,26-29에 의해 수정됩니다. 바이러스 성 RNA의 구조는 RIG-I과 PKR 활성화 (그리고 어떤 단계에서 바이러스 성 길항제 ㄴ 수있는의 더 나은 이해를위한E) 간섭, 그것은 정확하게 활성화 상태를 결정하는 것이 중요하다. 모두 PRRS를 위해 이전에 활성화가 트립신 내성 단백질 조각 6,17,30 및 고차 올리고머 6,18,19의 출현에 이르게 설명했다. 그러나, 항 바이러스 호스트 응답 1,2,24 이러한 핵심 요소에 대한 문학의 재산을 주어, 직접 방법의 응용 프로그램은 비교적 드문 것 같다. 광범위한 사용을 촉진의 희망, 우리는 견고 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 분석 할 수있는 편리하고 민감한 프로토콜을 제공합니다. IFN 유능한 인간 세포주 A549은 RIG-I과 PKR, 감쇠 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) (31, 32)의 설립 활성화에 감염된다. 간단한 용해하는 과정을 거친 후, 감염된 세포의 추출물 구조적 전환을 평가하기 위해 제한된 트립신 소화 / 웨스턴 블롯 분석에 의해 테스트되고 파란색 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE) / 웨스턴 블롯 분석가로올리고머의 형성을 측정하는 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

바이러스 감염에 대한 숙주 방어는 타고난 면역 시스템의 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의한 신속한 검출에 따라 달라집니다. 세포질에서, PRRS RIG-I 및 특정 바이러스 성 RNA의 리간드 PKR 바인딩. 이것은 첫 번째 구조적 전환 및 올리고머를 중재하고 항 바이러스 인터페론 반응의 활성화를 가능하게한다. 바이러스 숙주 유전자 발현을 측정하는 방법은 잘 확립되어 있지만, 직접 RIG-I 및 PKR의 활성 상태를 모니터링하는 방법은 부분적으로 만 이하이며 잘 확립. 여기, 우리는 설립 인터페론 유도, 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) 감염시 RIG-I과 PKR 자극을 모니터링하는 두 가지 방법을 설명합니다. 제한 트립신 소화 PRRS의 구조적 변화를 나타내는 단백질 분해 효소의 감도 변화를 분석 할 수 있습니다. RIG-I과 PKR, wherea의 급속한 저하의 모의 감염된 세포 결과에서 해물의 트립신 소화망할 CIA의 13 감염은 단백질 분해 효소 내성 RIG-I 조각의 출현에 이르게한다. 또한 PKR은의 Thr 446에 그것의 특징 인산화와 일치 트립신 소화에 바이러스에 의한 부분적인 저항을 보여줍니다. RIG-I과 PKR 올리고머 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 확인 된의 형성. 이 단백질은 모의 감염된 샘플 단량체로 남아있는 반면 감염되면, RIG-I과 PKR 올리고머 단지의 강한 축적이있다. 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지는 RIG-I과 PKR 활성화의 두 다양한 단계의 민감하고 직접 측정을 허용, 웨스턴 블롯 분석을 결합 둘. 이 기술은 상대적으로 쉽게 수행 할 수 신속하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다.

RIG-I 또는 PKR에 의한 바이러스 성 작용제의 인식은 구조적 전환 6,17,30 및 올리고머 6,18,27를 트리거합니다. 우리는 각각 제한된 단백질 분해 효소의 소화와 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해이 두 활성화 마커를 정량. 인간의 A549 세포는 IFN 길항제 NSS (35, 36)의 돌연변이에 의해 특징 리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 (망할 CIA...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

바이러스 감염에 타고난 방어는 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의해 실행됩니다. 두 세포질 PRRS RIG-I과 바이러스 서명 RNA를 변경 형태, 올리고머, 항 바이러스 신호를 활성화하기 위해 PKR 바인딩. 방법은 편리한 구조적인 스위칭 및 이러한 세포질 PRRS의 올리고머를 모니터링 할 수있는 기술되어있다.

항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

의 드문 경우에 이가와 조직 Transglutaminase이 항체에 의해 표피 Transglutaminase의 인식 붉은 털원숭이 피부염

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

연구

면역학 및 감염병학

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

C 형 간염 바이러스에 대한 인간 락토페린의 세포 흡수 및 관련 바이러스 활동을 모니터링하는 면역 형광

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...