Name: monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00
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Agradecemos Alejandro Brun do CISA-INIA para fornecer anti-febre Rift Vale Vírus soros. Trabalho em nossos laboratórios é suportado por Forschungsförderung jóia. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, da Escola de Pós-Graduação Leibniz para doenças virais emergentes (EIDIS), o DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, ea DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Sementeira de Células A549 para a Infecção <ol><li> Cultivar um frasco T75 de células A549 a 37 ° C e 5% de CO 2 em meio de cultura celular (DMEM suplementado com FCS a 10%, 526,6 mg / l de L-glutamina, 50,000 U / l de penicilina, e 50 mg / l de estreptomicina). </li><li> Antes de iniciar a colheita das células, aquecer-se o meio de cultura de células, PBS e 0,05% de tripsina-EDTA em um banho de água aquecida a 37 ° C. </li><li> Remover o meio e lava-se as células com 10 ml de PBS. Remover o PB...

Sentindo a presença de vírus e ativação do tipo I IFN antiviral sistema são cruciais para a resposta imune inata de sucesso 22. A detecção de vírus é assim mediada por receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs) como RIG-I e PKR, permitindo uma resposta rápida e ativação de mecanismos de defesa anti-virais. Aqui, descrevemos dois métodos para avaliar diretamente o status de ativação de RIG-I e PKR. Digestão protease limitada como uma ferramenta para monitorar...

Um acontecimento importante na defesa do hospedeiro antiviral é a detecção rápida do agente patogénico pelos chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) 1,2. Detecção intracelular de infecção por vírus de ARN é dependente de dois helicases de ARN citoplasmáticos, RIG-I (ácido retinóico gene indutível I) e MDA5 (diferenciação associado a melanoma de proteína 5) 3-5. RIG-I é composto por dois domínios N-terminais de recrutamento de caspase (cartões), um tipo de caixa de DECH-domínio RNA helicase central, e um domínio C-terminal (CTD) 4,6. Considerando que a CTD eo domínio helicase são necessários para o reconhecimento da não-auto (virais) RNAs, os cartões mediar sinalização a jusante levando ao estabelecimento de um estado anfitrião antiviral. Se RIG-I está no estado de silêncio, isto é, na ausência de um ligando de ARN específico, a segunda placa interage com o domínio da helicase central e mantém RIG-I numa conformação auto-inibidora 7-11. RIG-I liga-se a curto duploARN de cadeia (ds) contendo um 5&#39;-trifosfato (5&#39;PPP), dsRNA longo, e RNA PolyU / UC-rico, estruturas clássicas de assinatura que estão presentes nos genomas de muitos vírus de ARN de 12-16. Duas características principais de ativação RIG-I é uma mudança para uma conformação fechada 6,17 eo homo-oligomerização 6,18,19. A mudança conformacional aumenta a ligação do RNA, expõe os cartões para sinalização a jusante, e reconstitui um site ATPase ativa 8,9,11,20. A formação de complexos oligoméricos RIG-I conduz a uma melhor recrutamento de moléculas adaptadoras de sinalização a jusante de modo a formar uma plataforma para a transdução de sinal antiviral 11. A cadeia de sinalização RIG-I-regulada, eventualmente, ativa o fator de transcrição IRF-3 para o aumento da regulação do interferon (IFN-alpha/beta) genes e, portanto, a expressão gênica de genes interferon estimulada (ISGs) por uma resposta antiviral completo 21,22 . Um dos ISGs melhor caracterizada é a protei activado ARNn quinase (PKR) 23. PKR pertence à família do factor de iniciação da tradução eucariótica 2 alfa (eIF2α) quinases e é composta de um domínio de cadeia dupla de RNA de ligação N-terminal e um domínio de cinase de terminal-C. O domínio cinase constitui a interface de dimerização crucial para a activação PKR e realiza as funções catalíticas da proteína. A ligação de PKR para dsRNA viral leva à sua alteração conformacional que permite a dimerização e auto-fosforilação em Thr 446 entre outros resíduos. PKR então medeia fosforilação de eIF2α, bloqueando assim a tradução de mRNAs viral 23-27. Ambos RIG-I e PKR sofrer grandes rearranjos estruturais, formam complexos oligoméricas e são modificada após a tradução por fosforilação / desfosforilação e ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Para uma melhor compreensão do que as estruturas do RNA viral está ativando RIG-I e PKR (e em que estágio antagonistas virais poderia be interferindo), é importante para determinar com precisão o estado de activação. Para ambos os PRRs foi previamente descrito que a activação conduz ao aparecimento de fragmentos de proteína de tripsina-resistente 6,17,30 e oligómeros de ordem superior 6,18,19. No entanto, dada a riqueza da literatura sobre esses fatores-chave da resposta do hospedeiro antiviral 1,2,24, a aplicação de métodos diretos parece comparativamente raros. Na esperança de estimular o uso mais amplo, nós fornecemos protocolos convenientes e sensíveis para analisar de forma robusta os estados de ativação de RIG-I e PKR. O IFN competente linha celular humana A549 está infectado com um ativador estabelecido de RIG-I e PKR, o atenuado vírus da febre do Vale do Rift clone mutante 13 (Cl 13) 31,32. Depois de um procedimento de lise simples, os extratos de células infectadas são testados por tripsina digestão / western blot limitado para avaliar mudança conformacional, e pelo azul de eletroforese em gel de poliacrilamida nativa (PAGE) / analys Western bloté medir a formação de oligômeros.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Defesas do hospedeiro à infecção do vírus são dependentes de uma rápida detecção pelos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) do sistema imune inato. No citoplasma, PRRS RIG-I e PKR de ligação a ligandos específicos de RNA viral. Esta primeira medeia comutação conformacional e oligomerização, e, em seguida, permite a ativação de uma resposta interferon antiviral. Embora os métodos para medir a expressão do gene antiviral acolhimento estão bem estabelecidos, os métodos para monitorar diretamente os estados de ativação de RIG-I e PKR são apenas parcialmente e menos bem estabelecida. Aqui, descrevemos dois métodos para monitorar estimulação RIG-I e PKR sobre a infecção com um indutor interferon estabelecido, o vírus da febre do Vale do Rift clone mutante 13 (Cl 13). Digestão de tripsina limitada permite analisar as alterações na sensibilidade da protease, indicando alterações de conformação de PRRS. Digestão de tripsina de lisados ​​de simulações de células infectadas resulta em uma rápida degradação da RIG-I e PKR, whereainfecção s Cl 13 leva ao surgimento de um RIG-I fragmento resistente à protease. Também PKR mostra uma resistência parcial induzida por vírus para a digestão com tripsina, o qual coincide com a sua fosforilação marca em Thr 446. A formação de RIG-I e oligómeros PKR foi validado por electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE). Após a infecção, há um forte acumulação de RIG-I e complexos oligoméricos PKR, que estas proteínas permaneceram como monómeros em amostras infectadas simuladas. Digestão protease limitada e PAGE nativa, ambos acoplados a análise western blot, permitir uma medição sensível e direta de dois diferentes etapas do RIG-I e ativação PKR. Estas técnicas são relativamente fácil e rápido de executar e não requer equipamento caro.

O reconhecimento de um agonista viral por RIG-I ou PKR desencadeia mudança conformacional 6,17,30 e oligomerização 6,18,27. Analisamos estes dois marcadores de activação por digestão com protease limitado e electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE), respectivamente. As células A549 humanas infectadas com o clone de vírus da febre do vale do Rift 13 (Cl 13), que é caracterizada por uma mutação do antagonista de IFN NSS 35,36. Devido à au...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Defesas inata de infecções por vírus são acionados por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Os dois PRRs citoplasmáticos RIG-I e PKR ligam para RNAs virais de assinatura, mudança de conformação, oligomerizar e ativar sinalização antiviral. São descritos métodos que permitem monitorizar convenientemente a comutação conformacional e a oligomerização destes PRRs citoplasmáticos.

Monitoramento de ativação do Padrão Antiviral Reconhecimento Receptores RIG-I e PKR por limitada Protease Digestão e PAGE nativo

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Imunologia e Infecção

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Imunofluorescência para monitorar a Incorporação celular de lactoferrina humana e sua Associated atividade antiviral contra o vírus da hepatite C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

No início virais Ensaios de entrada para a identificação e avaliação de compostos antivirais

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

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o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Gerando<em&gt; De Novo</em&gt; Antígeno-específica T Humano receptores celulares por Transdução retroviral de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

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Arbovírus infecções como ferramentas de triagem para a identificação de fatores Antiviral Viral de imunomoduladores e Host

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

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Co-imunoprecipitação ensaio para estudar interações funcionais entre receptores e enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

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Digestão do fígado murino para um fluxo Cytometric análise de células endoteliais linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

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Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

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Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

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