Name: monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Agradecemos a Alejandro Brun de CISA-INIA para proporcionar anti-sueros Rift La fiebre del valle Virus. El trabajo en nuestros laboratorios se apoya en Forschungsförderung joya. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, la Escuela de Graduados de Leibniz para las enfermedades virales emergentes (Eidis), la DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, y la DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Siembra de células A549 para la infección <ol><li> Cultivar un matraz T75 de células A549 a 37 ° C y 5% de CO2 en medio de cultivo celular (DMEM suplementado con 10% de FCS, 526,6 mg / l de L-glutamina, 50.000 U / l de penicilina, y 50 mg / l de estreptomicina). </li><li> Antes de comenzar a cosechar las células, calentar medio de cultivo celular, PBS y 0,05% de tripsina-EDTA en un baño de agua calentado a 37 ° C. </li><li> Se retira el medio y se lavan las células con 10 ml de PBS. Retire la PBS...

Detección de la presencia de virus y la activación del sistema de tipo antiviral I IFN son cruciales para la respuesta inmune innata de éxito 22. La detección de virus es por ello mediado por los receptores de reconocimiento de patógenos (PRRS) como RIG-I y PKR, lo que permite una respuesta rápida y la activación de mecanismos de defensa antiviral. Aquí se describen dos métodos para evaluar directamente el estado de activación de RIG-I y PKR. Digestión con proteasa Limi...

Un evento crucial en la defensa del huésped antiviral es la detección rápida del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrón de llamadas (PRRS) 1,2. La detección intracelular de la infección por virus de ARN depende de dos helicasas de ARN citoplásmico, RIG-I (ácido retinoico de genes inducibles I) y MDA5 (proteína asociada a la diferenciación del melanoma 5) 3-5. RIG-I está compuesta por dos dominios N-terminales de reclutamiento de caspasas (tarjetas), un tipo DECH-box RNA helicasa dominio central, y un dominio C-terminal (CTD) de 4,6. Considerando que el CTD y el dominio helicasa se requieren para el reconocimiento de la no auto RNAs (virales), las tarjetas median la señalización corriente abajo que conduce a establecimiento de un estado anfitrión antiviral. Si RIG-I está en el estado de silencio, es decir, en ausencia de un ligando de ARN específico, la segunda tarjeta interactúa con el dominio helicasa central y mantiene GAR-I en una conformación auto-inhibidor 7-11. RIG-I se une a corto doble-hebra (ds) de ARN que lleva un 5&#39;-trifosfato (5&#39;PPP), largo dsRNA, y polyU / UC-rica ARN, estructuras de firma clásicos que están presentes en los genomas de muchos virus de ARN 12-16. Dos características importantes de la activación de RIG-I son un cambio a una conformación cerrada 6,17 y la homo-oligomerización 6,18,19. El cambio conformacional mejora ARN vinculante, expone las tarjetas de señalización corriente abajo, y reconstituye un sitio ATPasa activa 8,9,11,20. La formación de complejos oligoméricos RIG-I conduce a una mayor captación de las moléculas adaptadoras de señalización aguas abajo para formar una plataforma para la transducción de señales antiviral 11. La cadena de señalización regulada por el RIG-I se activa con el tiempo el factor de transcripción IRF-3 para la regulación de interferón genes (IFN-alpha/beta) y por lo tanto la expresión génica de los genes de interferón estimulado (ISGs) para una respuesta antiviral completa 21,22 . Uno de los mejor caracterizados ISGs es la proteinuria ARN-activadon quinasa (PKR) 23. PKR pertenece a la familia de iniciación de la traducción eucariótica factor de 2 alfa (eIF2α) quinasas y se compone de un dominio de ARN de doble cadena de unión y un dominio C-terminal de la quinasa N-terminal. El dominio quinasa constituye la interfaz de dimerización crucial para la activación de PKR y lleva a cabo las funciones catalíticas de la proteína. La unión de PKR a dsRNA viral conduce a su cambio conformacional que permite la dimerización y auto-fosforilación en Thr 446, entre otros residuos. PKR continuación, media la fosforilación de eIF2α, bloqueando de este modo la traducción de los ARNm viral 23-27. Tanto RIG-I y PKR sufrir importantes reajustes estructurales, forman complejos oligómeros y son después de la traducción modificado por fosforilación / desfosforilación y ubiquitinación 10,11,19,23,24,26-29. Para una mejor comprensión de lo que las estructuras de ARN virales están activando RIG-I y PKR (y en qué etapa antagonistas virales podrían be interferir), es importante determinar con precisión el estado de activación. Para ambos parentales que se ha descrito anteriormente que la activación conduce a la aparición de fragmentos de proteína resistente a tripsina 6,17,30 y oligómeros de orden superior 6,18,19. Sin embargo, dada la gran cantidad de literatura sobre estos factores clave de la respuesta del huésped antiviral 1,2,24, la aplicación de métodos directos parece relativamente rara. En la esperanza de estimular el uso más amplio, ofrecemos protocolos convenientes y sensibles para analizar con firmeza los estados de activación de RIG-I y PKR. El IFN competente línea celular humana A549 está infectado con un activador establecida de RIG-I y PKR, el virus de la fiebre del Valle del Rift atenuada clon mutante 13 (Cl 13) 31,32. Después de un procedimiento de lisis simple, los extractos de células infectadas se prueban por digestión análisis de transferencia limitada tripsina / Western para evaluar conmutación conformacional, y por azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (PAGE) / Analys Western blotes medir la formación de oligómeros.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Las defensas del huésped a la infección por virus dependen de una detección rápida por los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) del sistema inmune innato. En el citoplasma, los derechos y responsabilidades parentales RIG-I y PKR se unen a ligandos específicos de ARN viral. Esta primera media la conmutación conformacional y oligomerización y, a continuación, permite la activación de una respuesta antiviral de interferón. Si bien los métodos para medir la expresión de genes antivirales de acogida están bien establecidos, los métodos para supervisar directamente los estados de activación de RIG-I y PKR son sólo parcialmente y menos bien establecidos. Aquí se describen dos métodos para controlar RIG-I y PKR estimulación tras la infección con un inductor de interferón establecido, el virus de la fiebre del Valle del Rift clon mutante 13 (Cl 13). Digestión con tripsina Limited permite analizar las alteraciones en la sensibilidad a la proteasa, lo que indica cambios conformacionales de los derechos y responsabilidades parentales. La digestión con tripsina de lisados ​​de simulacros de las células infectadas como resultado una rápida degradación de RIG-I y PKR, whereas Cl 13 infección conduce a la aparición de un fragmento resistente a la proteasa RIG-I. También PKR muestra una resistencia parcial inducida por el virus de la digestión de la tripsina, que coincide con su fosforilación en Thr sello 446. La formación de RIG-I y oligómeros PKR fue validado por electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE). Tras la infección, existe una fuerte acumulación de RIG-I y complejos oligoméricos PKR, mientras que estas proteínas se mantuvieron como monómeros en muestras infectados de forma simulada. Digestión con proteasa Limited y PAGE nativa, tanto acopladas a análisis de Western blot, permiten una medición sensible y directa de dos diversas etapas de RIG-I y la activación de PKR. Estas técnicas son relativamente fácil y rápido de realizar y no requieren equipos costosos.

El reconocimiento de un agonista viral RIG-I o PKR desencadena conmutación conformacional 6,17,30 y oligomerización 6,18,27. Estamos analizarse estos dos marcadores de activación por digestión con proteasa limitada y electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE), respectivamente. Células A549 humanas fueron infectadas con el clon de virus de la fiebre del Valle del Rift 13 (Cl 13), que se caracteriza por una mutación del antagonista de IFN NSS 35,36.<...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Defensas innatas a las infecciones por virus son provocados por los receptores de reconocimiento de patrones (RRP). Los dos PRRs citoplasmáticos RIG-I y PKR se unen a los ARN virales de firma, cambio de conformación, oligomerize y activar la señalización antiviral. Se describen procedimientos que permiten controlar cómodamente el cambio conformacional y la oligomerización de estos derechos y responsabilidades parentales citoplasmáticos.

Monitoreo La activación del antiviral Pattern Recognition Receptores RIG-I Y PKR Por Limited proteasa Digestión y PÁGINA Nativo

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Reconocimiento de la transglutaminasa epidérmica por IgA y anticuerpos transglutaminasa tisular 2 en un raro caso de Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Investigación

Inmunología e Infección

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

La inmunofluorescencia para supervisar la captación celular de lactoferrina humana y su Asociado actividad antiviral contra el virus de hepatitis C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Ensayos pronta entrada virales para la identificación y evaluación de compuestos antivirales

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generando<em&gt; De Novo</em&gt; T humanas receptores de células específicas de antígeno por retroviral Transducción de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Infecciones del arbovirus como herramientas de detección para la identificación de factores antivirales inmunomoduladores y anfitrión Viral

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Ensayo de co-inmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre los receptores y enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestión del hígado murino para el análisis cytometric del flujo de las células endoteliales linfáticas

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Proyección de imagen confocal de ARN bicatenario y receptores de reconocimiento de patrón en la infección por Virus de ARN de sentido negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...