Name: monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Vi tackar Alejandro Brun från CISA-INIA för att ge anti-Rift Valley-feber Virus sera. Arbetet i våra laboratorier stöds av Forschungsförderung pärla. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Leibniz forskarskolan Emerging virussjukdomar (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, och DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

1. Sådd av A549 celler för infektion <ol><li> Odla en T75-kolv med A549-celler vid 37 ° C och 5% CO2 i cellodlingsmedium (DMEM kompletterat med 10% FCS, 526,6 mg / l L-glutamin, 50,000 U / l penicillin och 50 mg / l streptomycin). </li><li> Innan man börjar skörda cellerna, värma upp cellkulturmedium, PBS och 0,05% trypsin-EDTA i ett vattenbad upphettades till 37 ° C. </li><li> Ta ut mediet och tvätta cellerna med 10 ml PBS. Ta bort PBS igen. </li><li> Tillsätt 3 ml trypsin-EDTA och fördela jämnt...

Sensing förekomsten av virus och aktivering av det antivirala typ I IFN-systemet är avgörande för framgångsrika medfödda immunsvar 22. Virus upptäckt därmed förmedlas av patogen igenkänningsreceptorer (PRRS) som RIG-I och PKR, möjliggör ett snabbt svar och aktivering av antivirala försvarsmekanismer. Här beskriver vi två metoder för att direkt utvärdera aktiveringsstatus för RIG-I och PKR. Begränsad proteasspjälkning som ett verktyg för att övervaka konformat...

En avgörande händelse i antivirala värdförsvar är den snabb upptäckt av patogenen genom de så kallade mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) 1,2. Intracellulär upptäckt av RNA-virus infektion är beroende av två cytoplasmiska RNA helikaser, RIG-I (retinoinsyra inducible gen I) och MDA5 (melanom differentiering associerat protein 5) 3-5. RIG-I består av två N-terminala caspase rekryterings domäner (CARDS), en central DECH-box typ RNA-helikas domän och en C-terminal domän (CTD) 4,6. Medan CTD och helikas domän krävs för erkännande av icke-själv (virus) RNA, korten medla nedströms signalering som leder till upprättandet av en antiviral värdstatus. Om RIG-I är i tyst tillstånd, dvs i frånvaro av en specifik RNA-ligand, samverkar det andra kortet med den centrala helikas domän och håller RIG-I i en auto-inhiberande konforma 7-11. RIG-I binder till korta dubbel-strängen (ds)-RNA som bär en 5&#39;-trifosfat (5&#39;PPP) långt dsRNA och PolyU / UC-rikt RNA, klassiska signatur strukturer som är närvarande på genomen hos många RNA-virus 12-16. Två viktiga egenskaper hos RIG-I aktivering är en övergång till en sluten konforma 6,17 och homo-oligomerisering 6,18,19. Den konforma switch ökar RNA bindande, exponerar korten för nedströms signalering, och återskapar ett aktivt ATPas webbplats 8,9,11,20. Bildningen av oligomera RIG-I-komplex leder till förbättrad rekrytering av nedströms signaleringsadaptermolekyler för att bilda en plattform för antiviral signaltransduktion 11. Rig-I-reglerad signaleringskedja aktiverar slutligen transkriptionsfaktorn IRF-3 för uppreglering av interferon (IFN-alpha/beta) gener och således genuttrycket av interferonstimulerad gener (ISGs) för en full antiviralt svar 21,22 . En av de bästa karakteriserade ISGs är RNA-aktiverade protein-kinas (PKR) 23. PKR tillhör familjen av eukaryot translationsinitiering faktor 2 alfa (eIF2α) kinaser och är sammansatt av en N-terminal dubbelsträngade RNA-bindande domän och en C-terminal kinasdomän. Kinasdomänen utgör den dimerise gränssnitt avgörande för PKR-aktivering och utför de katalytiska funktionerna hos proteinet. Bindning av PKR till viral dsRNA leder till dess conformationaländring medger dimerisering och auto-fosforylering vid Thr 446 bland andra rester. PKR förmedlar sedan fosforylering av eIF2α, därigenom blockera översättningen av viralt mRNA 23-27. Både RIG-I och PKR genomgår stora strukturella omorganiseringar, bilda oligomera komplex och är post-translationellt modifierat genom fosforylering / defosforylering och ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. För en bättre förståelse för vilka virala RNA strukturer aktiverar RIG-I och PKR (och i vilket skede virus antagonister kunde be interfererande), är det viktigt att exakt bestämma aktiveringsstatus. För båda PRRs det tidigare beskrivits att aktivering leder till uppkomsten av trypsin-resistent proteinfragment 6,17,30 och högre ordningens oligomerer 6,18,19. Men med tanke på den stora mängd litteratur om dessa nyckelfaktorer för den antivirala värdsvaret 1,2,24, verkar tillämpa direkta metoder devis sällsynta. I hopp om att stimulera en bredare användning, erbjuder vi bekväma och känsliga protokoll för att kraftfullt analysera aktiveringstillstånd RIG-I och PKR. IFN kompetent human cellinje A549 är infekterad med en etablerad aktivator av RIG-I och PKR, den försvagade Rift Valley febervirus mutant klon 13 (Cl 13) 31,32. Efter en enkel lyserförfarande, är extrakt av infekterade celler testas av begränsad trypsindigestion / western blot-analys för att utvärdera konforma växling, och med blå infödda polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) / Western blot-analysär att mäta bildningen av oligomerer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Värd försvar till virusinfektion är beroende av en snabb detektering av mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS) i det medfödda immunförsvaret. I cytoplasman PRRS RIG-I-och PKR binda till specifika virala RNA-ligander. Detta förmedlar först konforma växling och oligomerisering, och sedan möjliggör aktivering av en antiviral interferonsvar. Även om metoder för att mäta antiviral värd-genexpression är väl etablerade metoder för att direkt övervaka aktiveringstillstånd RIG-I och PKR endast delvis och mindre väl etablerad. Här beskriver vi två metoder för att övervaka RIG-I och PKR stimulering efter infektion med en etablerad interferoninducerare, Rift Valley febervirus muterad klon 13 (Cl 13). Begränsad trypsindigerering gör det möjligt att analysera förändringar i proteas känslighet, vilket tyder på konformationsändringar av PRRS. Trypsin digestion av lysat från skeninfekterade celler resulterar i en snabb nedbrytning av RIG-I och PKR whereas Cl 13-infektion leder till uppkomsten av en proteas-resistent RIG-fragmentet. Också PKR visar en virus-inducerad partiell resistens mot trypsin digestion, som sammanfaller med dess kännetecken fosforylering vid Thr 446. Bildningen av RIG-I och PKR oligomerer validerades genom nativ polyakrylamidgelelektrofores (PAGE). Efter infektion, finns det en stark ansamling av RIG-I och PKR oligomera komplexen, medan dessa proteiner kvar som monomerer i mock-infekterade prover. Begränsad proteasspjälkning och infödda SIDA, båda kopplade till western blot-analys, tillåta en känslig och direkt mätning av två olika steg i RIG-I och PKR-aktivering. Dessa tekniker är relativt lätt och snabbt att utföra och kräver ingen dyr utrustning.

Erkännande av en virus-agonist med RIG-I eller PKR utlöser konforma växling 6,17,30 och oligomerisering 6,18,27. Vi analyserade dessa två aktiveringsmarkörer genom begränsad proteasdigestion och nativ polyakrylamidgelelektrofores (PAGE), respektive. Humana A549-celler infekterade med Rift Valley febervirus klon 13 (Cl 13), som kännetecknas av en mutation av IFN antagonisten NSs 35,36. På grund av avsaknaden av funktionella NSs, klon 13 inducerar stark...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Innate försvar till virusinfektioner utlöses av mönsterigenkänningsreceptorer (PRRS). De två cytoplasmiska PRRs RIG-I och PKR binder till virussignatur RNA, ändra konformation, oligomerisera och aktivera antivirala signalering. Metoder beskrivs som tillåter att bekvämt övervaka konforma växling och oligomerisering av dessa cytoplasmiska PRRs.

Övervakning Aktivering av antivirala Pattern Recognition Receptors RIG-I och PKR By Limited proteasspjälkning och Native SIDA

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Erkännande av Epidermal transglutaminas av IgA och Tissue transglutaminas 2 antikroppar i ett enstaka fall av Rhesus Dermatit

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescens att Övervaka Cellular Upptag av humant laktoferrin och dess associerade antiviral aktivitet mot hepatit C-virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Tidig viralt inträde Analyser för identifiering och utvärdering av antivirala föreningarna

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

De<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur och mönsterigenkänning receptorstimulering av Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Alstrande<em&gt; De Novo</em&gt; Antigenspecifika Human T-cellreceptorer från Retroviral Transduction av Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Arbovirus infektioner som Screening verktyg för identifiering av Viral immunmodulerande och värd antivirala faktorer

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation analysmetod för att studera funktionella interaktioner mellan receptorer och enzymer

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Rötning av murina levern för ett flöde flödescytometrisk analys av lymfatiska endotelceller

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Confocal Imaging av dubbelsträngat RNA och mönster erkännande receptorer i negativ-Sense RNA-virusinfektion

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Protokoll för bildbehandling för analys av diffusionen och klusterstorleken av membranreceptorer av fluorescensmikroskopi

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...