Name: monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Biz anti-Rift Vadisi Humması Virüs serumları sağlamak için CISA-INIA Alejandro Brun teşekkür ederim. Bizim laboratuarlarımızda çalışma Forschungsförderung taş tarafından desteklenmektedir. 2. Abs §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, Gelişen viral hastalıklar için Leibniz Enstitüsü (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 ve DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Enfeksiyon için A549 Hücrelerinin 1. Tohum <ol><li> 37 ° C&#39;de A549 hücrelerinin bir T75 şişesi yetiştirmek ve% 5 hücre kültür ortamı içinde 2, CO (DMEM,% 10 FCS, 526.6 mg / L L-glutamin, 50,000 U / L penisilin ve 50 mg / l streptomisin ile takviye edilmiştir). </li><li> Hücreleri toplamak için başlamadan önce, 37 ° C&#39;ye ısıtılmış bir su banyosu içinde, hücre kültür ortamı, PBS ve% 0.05 tripsin-EDTA ısıtmak </li><li> Ortamı çıkarın ve 10 ml PBS ile hücreleri yıkay?...

Virüslerin varlığı ve sistem IFN antiviral Çeşidi aktivasyonunu algılama başarılı bir doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin 22 için çok önemlidir. Virüs algılama ve böylece hızlı bir tepki ve antiviral savunma mekanizmalarının aktivitesini sağlayan, Rig-I ve PKR gibi patojen tanıyan reseptörler (PRR) aracılık eder. Burada, doğrudan Rig-I ve PKR aktivasyon durumunu değerlendirmek için iki yöntem açıklanmaktadır. Rig-I ve PKR&#39;nin yapısal ...

Antiviral konak savunmasında çok önemli bir etkinlik sözde görüntü tanıma reseptörleri (PRR) 1,2 patojeni hızlı tespit edilmesidir. RNA virüs enfeksiyonu tespiti, iki hücre içi sitoplazmik RNA sarmallara Rig-I (retinoik asit olarak uyarılabilir bir gen I) &#39;in ve MDA5 (melanoma farklılaşma ilişkili protein 5) 3-5 bağlıdır. Rig-I, iki N-ucu kaspaz alım alanları (kart), merkezi bir Dech kutu tipi RNA helikaz etki alanı ve bir C-terminal alanının (CTD) 4,6 oluşmaktadır. CTD ve sarmal etki non-self (viral) RNA&#39;lar tanınması için gerekli ise, kARtlARI bir antiviral sahibi durumundaki kurulmasına yol açan aşağı sinyalizasyon aracılık. Rig-I, belirli bir RNA ligandın yokluğunda yani sessiz durum içinde ise, ikinci bir kart merkezi sarmal alanı ile etkileşime girer ve bir otomatik engelleyici konformasyonunda 7-11 Rig-I tutar. Rig-Ben kısa bağlanır çiftbir 5&#39;-trifosfat (5&#39;PPP) ve uzun dsRNA, polyU ve / UC açısından zengin RNA, birçok DNA virüsünün 12-16 genomlarında üzerinde mevcut olan klasik imza yapıları taşıyan iplik (ds) RNA. Rig-I aktivasyonu iki temel özellikleri kapalı konformasyon 6,17 ve homo-oligomerizasyonun 6,18,19 bir anahtar vardır. Yapısal anahtarı, RNA bağlayıcı geliştirir aşağı sinyalizasyon için kartlar ortaya, ve aktif bir ATPaz sitesi 8,9,11,20 yeniden oluşturulmasını. Oligomerik Rig-I komplekslerinin oluşumu antiviral sinyal iletimi 11 için bir platform oluşturmak için aşağı doğru sinyal adaptör moleküllerinin gelişmiş işe yol açar. Rig-I-regüle sinyal zinciri sonunda transkripsiyon faktörünü aktive IRF-3 için yukarı-regülasyonu tam bir antiviral karşılık 21,22 için interferon (IFN-alpha/beta) genleri ve interferon uyarılan genlerin dolayısıyla gen ifadesi (ISGs) arasında . En iyi karakterize edilmiş ISGs bir RNA ile aktive olan Protein kinaz (PKR) 23. PKR ökaryotik translasyon başlatma faktörü alfa 2 (eIF2α) kinazları ailesine ait olan ve bir N-terminal çift-şeritli RNA bağlama alanı ve bir C-terminal kinaz oluşmaktadır. Kinaz etki PKR dimerizasyon aktivasyonu için önemli bir arayüz oluşturur ve proteinin katalitik işlevleri yerine getirir. Viral dsRNA PKR bağlanması, bunun yapısal değişiklik diğer artıklar arasında yer Thr 446 dimerizasyonu ve oto-fosforilasyonunu izin yol açar. PKR sonra bu şekilde viral mRNA 23-27 çevirisini bloke eIF2α fosforilasyonunu aracılık eder. Rig-I ve PKR her ikisi de, önemli bir yapısal yeniden düzenlemeleri geçmesi oligomerik kompleksler oluşturmak ve post-translasyonel fosforilasyon / defosforilasyon ve ubikitinasyon 10,11,19,23,24,26-29 ile tadil edilmiş metilalümoksandır. Viral RNA yapıları Rig-I ve PKR&#39;yi aktive edilir (ve hangi aşamada viral antagonist b olabilecek daha iyi anlaşılması içine) müdahale, bu tam etkinleştirme durumunu belirlemek için önemlidir. Her iki PRRS için bir önceki aktivasyon trypsin&#39;e dirençli protein fragmanlarının 6,17,30 ve daha yüksek dereceden oligomerlerin 6,18,19 ortaya çıkmasına yol açar tanımlanmıştır. Ancak, antiviral konak yanıtının 1,2,24 bu anahtar faktörlere edebiyatının zenginliği göz önüne alındığında, doğrudan yöntemler uygulama nispeten nadir görünüyor. Geniş kullanım uyarıcı umuduyla olarak, sağlam Rig-I ve PKR&#39;nin aktivasyon durumları analiz etmek için uygun ve hassas protokolleri sağlar. IFN yetkin insan hücre hattı A549 Rig-I ve PKR, zayıflatılmış Rift Valley ateşli virüsü mutant klonu 13 (Cı-13) 31,32 yerleşik bir aktivatör ile enfekte edilir. Basit bir parçalama işleminden sonra, enfekte olmuş hücrelerin ekstreleri konformasyonel geçiş değerlendirmek için sınırlı tripsin sindirim / western blot analizi ile test edildi ve mavi olan yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) / Western blot analizi çalışan tarafındanoligomerlerin oluşumunu ölçmektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

Virüs enfeksiyonu konak savunması doğuştan gelen bağışıklık sisteminin örüntü tanıma reseptörleri (PRR&#39;ler) tarafından hızlı bir algılama bağlıdır. Sitoplazmada, PRR Rig-I ve belirli viral RNA ligandlarına PKR bağlanır. Bu, ilk olarak yapısal ve anahtarlama oligomerizasyonu aracılık etmekte ve daha sonra bir anti-viral tepki interferon aktivasyonunu sağlar. Antiviral bir ev sahibi gen ekspresyonunu ölçmek için yöntemler iyi kurulmuş olsa da, doğrudan Rig-I ve PKR&#39;nin aktivasyon durumları izlemek için yöntemler, sadece kısmen ve daha az iyi bilinmektedir. Burada, kurulu bir interferon indükleyici, Rift Valley ateşli virüsü mutant klonu 13 (CI 13) ile enfeksiyon üzerine Rig-I ve PKR stimülasyon izlemek için iki yöntem tarif eder. Sınırlı tripsin sindirim PRRS şekilsel değişiklikleri gösteren, proteaz duyarlılık değişiklikleri analiz etmeyi sağlar. Rig-I ve PKR, anlamlara sahiptir: hızlı bir şekilde bozunması ile sahte enfeksiyonlu hücreler sonuçlarından lizatlarının tripsin sindirims Cı 13 enfeksiyonu bir peptidaza dayanıklı Rig-I fragmanının ortaya çıkmasına yol açar. Ayrıca PKR Thr 446 onun ayar damgası fosforilasyonu ile çakışmaktadır tripsin sindirim, bir virüs kaynaklı kısmi bir direnç gösterir. Rig-I ve PKR oligomerleri yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile doğrulandı oluşumu. Bu proteinlerin örnekleri sahte enfekte monomer olarak kalmıştır oysa enfeksiyon üzerine, Rig-I ve PKR oligomerik kompleksleri güçlü bir birikimi bulunmaktadır. Sınırlı proteaz sindirimi ve yerel PAGE, Rig-I ve PKR aktivasyon iki farklı adımları bir hassas ve doğrudan bir ölçüm sağlar, western blot analizi bağlanmış iki. Bu teknikler nispeten kolay ve gerçekleştirmek için hızlı ve pahalı ekipman gerektirmez.

Rig-I ya da PKR ile bir viral agonistinin tanınması konformasyonel anahtarlama 6,17,30 ve oligomerizasyon 6,18,27 tetikler. Biz ise, sınırlı bir proteaz sindirimi ve yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile bu iki etkinleştirme işaretleri analiz edilmiştir. Insan A549 hücreleri, IFN antagonist NSS 35,36 bir mutasyon ile karakterize Rift Valley ateşli virüsü klon 13 (CI 13) ile enfekte edilmiştir. Nedeniyle fonksiyonel NSS olmaması için,...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE at JoVE.com

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

Virüs enfeksiyonlarına karşı doğal savunma örüntü tanıma reseptörleri (PRR&#39;ler) tarafından tetiklenir. İki sitoplazmik PRR&#39;ler Rig-I ve viral imza RNA&#39;lar, değişim konformasyon, oligomerleşip ve antiviral sinyalini etkinleştirmek için PKR bağlamak. Yöntem, uygun yapısal anahtarlama ve bu sitoplazmik PRRS en oligomerizasyonu izlemek için izin tarif edilmiştir.

Antiviral Pattern Recognition reseptörler Rig-I Ve PKR By Limited Proteaz Sindirim ve Yerli PAGE izlenmesi aktivasyonu

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Nadir bir Case IgA ve Doku Transglutaminaz 2 Antikorlar Epidermal Transglutaminaz tanınması Rhesus Dermatit

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Hepatit C Virüsü Karşı İnsan laktoferrinin Hücresel Alımı ve İlişkili Antiviral Aktivite Monitör İmmünofloresan

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...