Name: quantitative proteomics using reductive dimethylation for stable isotope labeling
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00
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We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.

HINWEIS: Diese Methode wurde bereits beschrieben 12. 1. Proteinisolierung Herstellung von 1 mg Zellprotein durch Lysieren von Zellen, vorzugsweise durch physikalische Methoden wie Französisch Presse Wulst Schlagen oder Ultraschallbehandlung. Vermeiden Lysozym-vermittelte Zell-Lyse, weil das Enzym Massenspektrometrie Messungen zu verwechseln. 2. TCA-Fällung von Proteinen 1 Volumen Trichloressigsäu...

<ol>
	<li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology.">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li><li>Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Gygi, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database.">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Bakalarski, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367.">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li><li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells.">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li><li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics.">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses.">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li><li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins.">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li><li>Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+N(&#945;)-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX.">Improved N(&#945;)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis.">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li></ol>

Einige Punkte machen stabilen Isotopenmarkierung von Peptiden mittels reduktiven Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) eine attraktive Methode für die quantitative Proteomik: kostengünstige Markierungsreagenzien (Reagenzien kostet weniger als $ 1 pro Probe), schnelle Reaktionsgeschwindigkeit (~ 10 min), das Fehlen von Nebenprodukten, hohe Reproduzierbarkeit (Fig. 3, 4), stabiler Reaktionsprodukte, die Fähigkeit, eine beliebige Protease verwendet, und hohe Ionisierungseffizienz von markierten Peptiden. ...

Messkonzentrationsunterschiede vieler Proteine ​​zwischen komplexen Proben ist eine zentrale Herausforderung in der Proteomik. Zunehmend wird dies durch Markierung von Proteinen in jeder Probe mit unterschiedlichen Isotopen-Tags, die Kombination der Proben und mit Hilfe der Massenspektrometrie, um Konzentrationsunterschiede zu quantifizieren getan. Es gibt verschiedene Verfahren für stabile Isotopenmarkierung von Proteinen und Peptiden. Kennzeichnung 15 N 1 und 2 SILAC vorstellen Isotopenmarkierungen metabolisch in vivo, während iCAT 3, iTRAQ 4, 5 und Reduktion Dimethylierung nach der Proteinextraktion und Verdauung hinzufügen stabilen Isotopen-Tags. Unter diesen Verfahren wird die reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) an Popularität gewinnt als eine preiswerte, reproduzierbare Methode zur Proteinkonzentration Unterschiede in fast jeder Art von Probe zu quantifizieren. REDi Markierung beinhaltet die Umsetzung von Peptiden mit Formaldehyd zu einer Schiffschen Base, die dann reduziert wird, zu bilden,von Cyanoborhydrid. Diese Reaktion dimethylates freien Aminogruppen auf N-Termini und Lysin-Seitenketten und monomethylates N-terminale Prolin. Das hier beschriebene Protokoll methyliert Peptide in Probe 1 mit einem &quot;light&quot;-Label unter Verwendung von Reagenzien mit Wasserstoffatomen in ihrer natürlichen Isotopenverteilung und Probe 2 mit einer &quot;schweren&quot; Etikett mit deuteriertem Formaldehyd und Cyanoborhydrid (Abbildung 1). Jeder dimethylierten Aminogruppe auf einem Peptid zu einer Massendifferenz von 6,0377 Da zwischen leichten und schweren Formen, die verwendet wird, um zwischen den beiden Formen mit einem Massenspektrometer zu unterscheiden. Insbesondere werden relativen Häufigkeiten Peptid als das Verhältnis der MS1 extrahiert Ionenchromatogramm Bereiche (Peakflächenverhältnis MS1) von leichten und schweren Version für jedes Peptid Ionenpaar quantifiziert. Die relative Menge eines Proteins wird als Median MS1 ​​Peakflächenverhältnis aller Peptide in dem Protein errechnet. In diesem Bericht beschreiben wir ein robustes Protokoll für das Verhaltening Redi Markierungsexperimente mit LC-MS/MS, die Umkehrphasen-Peptid-Festphasenextraktion, On-Column-Kennzeichnung redi-, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-Reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und Reinigung der Peptidgemische mit StageTips (Abbildung 2) umfasst . Wir diskutieren Vor-und Nachteile der Verwendung von Redi Kennzeichnung für die quantitative Proteomik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="973">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T9159</td>
			<td style="width:319px;">protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">650501</td>
			<td>protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71736</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S8045</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">43816</td>
			<td>denature, reduce, alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">protease Inhibitor Complete Mini Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693124001</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td>alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">H7523</td>
			<td>resuspend, extract, label protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C5670</td>
			<td>resuspend protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">Lysyl Endoprotease</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td style="width:136px;">129-02541</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:136px;">V5111</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">320099</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">tC18 Sep-Pak C18 cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">extraction manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">14261</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71435</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">deuterated formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium cyanoborodeuteride</td>
			<td>CDN isotopes</td>
			<td style="width:136px;">D-1797</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 &#181;m particle size)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td style="width:136px;">770450-902</td>
			<td>basic pH reversed-phase chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">399388</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18 Empore Disks</td>
			<td>3M</td>
			<td style="width:136px;">14-386-3&#160;</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">494437</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics using reductive dimethylation for stable isotope labeling

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) ist eine Methode, um genau zu quantifizieren Proteinexpressionsunterschiede zwischen den Proben mit Hilfe der Massenspektrometrie. Redi Kennzeichnung erfolgt mit entweder regelmäßig (Licht) oder deuteriertes (Schwer-) Formen von Formaldehyd und Natriumcyanoborhydrid zu zwei Methylgruppen an jedem freien Amin hinzufügen. Hier zeigen wir, einen robusten Protokoll für REDi Kennzeichnung und quantitativen Vergleich von komplexen Proteingemischen. Proteinproben für den Vergleich sind in Peptide, beschriftet, entweder leicht oder schwer Methyl-Tags, gemischt und mittels LC-MS/MS analysiert Co-tragen verdaut. Relative Protein Häufigkeiten werden durch den Vergleich der Ionenchromatogramm Peakflächen von schweren und leichten markierten Versionen der Peptidbestandteil von der vollen MS-Spektren extrahiert quantifiziert. Das hier beschriebene Verfahren umfasst die Probenvorbereitung durch Umkehrphasen-Festphasenextraktion, On-Column-Redi Markierung von Peptiden, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und StageTip Peptidreinigung. Wir diskutieren Vorteile und Grenzen der redi Kennzeichnung gegenüber anderen Methoden zur stabilen Isotopen Gründung. Wir zeigen neue Anwendungen mit Redi Kennzeichnung als eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode, um die Proteinhäufigkeiten in fast jeder Art von Probe zu vergleichen.

Wir untersuchten die Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit der redi Kennzeichnung mit Saccharomyces cerevisiae und Clostridium phytofermentans Ganzzelllysaten. Wir haben zuerst quantifiziert die redi Markierungseffizienz aus einer Mischung von C phytofermentans Proteinlysate aus Cellulose (schwere beschriftet, H) und Glucose (Licht-Label, L) Kulturen. Wenn ein Peptid False Discovery Rate 1% gefiltert, enthielt diese Probe 11.194 einzigartige Peptidsequenzen mit einer Redi Markierungse...

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Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

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