Name: quantitative proteomics using reductive dimethylation for stable isotope labeling
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00
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We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.

注：この方法は、以前に12を説明した。 1。タンパク質の単離好ましくは、フレンチプレス、ビーズビーティング、または超音波のような物理的方法により、細胞を溶解することによって細胞タンパク質1mgを準備します。酵素は、質量分析の測定を混乱されますので、リゾチーム媒介細胞溶解を避けてください。 タンパク質...

<ol>
	<li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology.">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li><li>Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Gygi, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367.">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li><li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells.">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li><li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics.">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses.">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li><li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins.">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li><li>Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+N(&#945;)-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX.">Improved N(&#945;)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis.">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li></ol>

安価な標識試薬（試薬はサンプルあたり1ドル未満のコスト）、速い反応速度（〜10分）、副生成物が存在しない場合、高：いくつかのポイントが還元ジメチル化を使用して、ペプチドの安定同位体標識（REDIラベリング）定量的プロテオミクスのための魅力的な方法を作る再現性（ 図3、図4）、安定した反応生成物、任意のプロテアーゼを使用する能力、および標識されたペプチ?...

複雑なサンプル間の多くのタンパク質の濃度差を測定するプロテオミクスにおける中心的な課題である。ますます、このことは、異なる同位体タグを各試料中のタンパク質を標識するサンプルを結合し、濃度差を定量化するために質量分析法を用いて行われている。いくつかの方法がタンパク質およびペプチドの安定同位体標識のために存在しています。15 N標識の1やSILAC 2 ICAT 3、のiTRAQ 4、還元ジメチル化5は、タンパク質の抽出および消化後に安定同位体タグを追加する一方で、 生体内で代謝的に同位体標識を導入。これらの方法の中でも、還元ジメチル化（ラベリングのRedi）は、サンプルのほぼ任意のタイプのタンパク質濃度の違いを定量化するための安価な、再現性のある方法として人気を集めている。 REDI標識は、その後減少するシッフ塩基を形成し、ホルムアルデヒドとペプチドを反応させることを含むシアノ水素化による。この反応は、N-末端およびリジン側鎖およびmonomethylates N-末端のプロリンに遊離アミノ基をdimethylates。ここで説明するプロトコルは、重水素化ホルムアルデヒドとシアノ水素化ホウ素（ 図1）を使用して、「重い」のラベルとの天然の同位体分布とサンプル2の水素原子を有する試薬を使用した「光」ラベルでサンプル1中のペプチドをメチル化。光、質量分析計を用いて二つの形態間を区別するために使用される重質形態との間の6.0377 Daの質量差ペプチドの結果についての各ジメチル化アミノ基である。具体的には、ペプチドの相対存在量は、光のMS1抽出イオンクロマトグラムの面積の比（MS1ピーク面積比）と各ペプチドイオン対についての重鎖バージョンとして定量化される。タンパク質の相対存在量は、タンパク質中の全てのペプチドのうち、中央値MS1のピーク面積比として計算される。本稿では、行動のための堅牢なプロトコルを記述逆相ペプチド固相抽出、オンカラムのRedi標識、ペプチド分画塩基性pH位相（BPRP）クロマトグラフィーを反転し、StageTipsを用いてペプチド混合物を精製し（ 図2）を含むLC-MS/MSによってのRedi標識実験をING 。我々は定量的プロテオミクスのためREDIラベルを使用することの利点と制限について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="973">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T9159</td>
			<td style="width:319px;">protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">650501</td>
			<td>protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71736</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S8045</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">43816</td>
			<td>denature, reduce, alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">protease Inhibitor Complete Mini Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693124001</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td>alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">H7523</td>
			<td>resuspend, extract, label protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C5670</td>
			<td>resuspend protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">Lysyl Endoprotease</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td style="width:136px;">129-02541</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:136px;">V5111</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">320099</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">tC18 Sep-Pak C18 cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">extraction manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">14261</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71435</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">deuterated formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium cyanoborodeuteride</td>
			<td>CDN isotopes</td>
			<td style="width:136px;">D-1797</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 &#181;m particle size)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td style="width:136px;">770450-902</td>
			<td>basic pH reversed-phase chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">399388</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18 Empore Disks</td>
			<td>3M</td>
			<td style="width:136px;">14-386-3&#160;</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">494437</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics using reductive dimethylation for stable isotope labeling

還元ジメチル化（ラベリングのRedi）によるペプチドの安定同位体標識を正確に質量分析を使用して試料間のタンパク質発現の差異を定量化する方法である。 REDI標識は、各フリーアミンに2個のメチル基を追加するために、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを定期的に（光）または重水素化（重）の形式のいずれかを使用して実行されます。ここでは、REDI標識および複雑なタンパク質混合物の定量的な比較のための堅牢なプロトコルを示しています。比較のためのタンパク質試料を光や重いメチルタグ、混合し、LC-MS/MSによって共同で分析のいずれかを実行するために標識されたペプチドの中に消化される。タンパク質の相対存在量は、全MSスペクトルから抽出された成分ペプチドの重鎖及び軽標識バージョンのイオンクロマトグラムのピーク面積を比較することにより定​​量される。ここで説明する方法は、塩基性のpH REVによる逆相固相抽出によるサンプル調製、ペプチドのオンカラムREDIラベル、ペプチド分画を含んでいるersed相（BPRP）クロマトグラフィー、およびStageTipペプチド精製。当社は、安定同位体の組み込みのための他の方法に関してREDIラベルの利点と制限について説明します。我々は、サンプルのほぼすべてのタイプの中のタンパク質の存在量を比較するために、高速で安価な、そして正確な方法としてREDIのラベリングを用いた新規のアプリケーションを強調表示します。

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeを使用して正確さ、精度、およびREDIラベルの再現性を評価し、 クロストリジウムは、全細胞溶解物をphytofermentans。まず、CのミックスのRediの標識効率を定量化セルロース（重ラベル、H）とグルコース（光ラベル、L）の培養物からタンパク質溶解物をphytofermentans。 1％ペプチド偽発見率に濾過する場合、このサンプルは、98％のRed...

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Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Research

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

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Improved In-gel Reductive ÃƒÅ½Ã‚Â²-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry

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