Name: quantitative proteomics using reductive dimethylation for stable isotope labeling
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00
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We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.

NOTA: Este método foi descrito anteriormente 12. 1. Isolamento de Proteínas Prepare 1 mg de proteína celular por lise das células, de preferência, por meio de métodos físicos, tais como a prensa francesa, grânulo batimento, ou de ultra-sons. Evitar a lise celular mediada por lisozima porque a enzima irá confundir medições de espectrometria de massa. 2. Precipitação de TCA de Proteínas ...

<ol>
	<li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology.">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li><li>Ong, S. -. E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture,+SILAC,+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics.">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li><li>Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags.">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular &amp; cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li><li>Hsu, J. -. L., Huang, S. -. Y., Chow, N. -. H., Chen, S. -. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database.">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Bakalarski, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+peptide+abundance+and+dynamic+range+on+stable-isotope-based+quantitative+proteomic+analyses.">The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).</li><li>Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+fasted+and+re-fed+mouse+liver+phosphoproteomes+using+lower+pH+reductive+dimethylation.">Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation.</a> Methods (San Diego, Calif.). , (2013).</li><li>Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+systems+analysis+of+a+cellulosic+biofuel-producing+microbe.">Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe.</a> Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).</li><li>Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367.">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li><li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells.">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li><li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics.">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li><li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses.">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li><li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplex+protein+quantification+based+on+stable+isotope+labeling+by+peptide+dimethylation+applied+to+cell+and+tissue+lysates.">Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates.</a> Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-plex+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).</li><li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics.">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li><li>She, Y. -. M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins.">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li><li>Chen, S. -. H., Chen, C. -. R., Chen, S. -. H., Li, D. -. T., Hsu, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+N(&#945;)-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX.">Improved N(&#945;)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis.">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li></ol>

Vários pontos tornar a rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos usando um método atraente para proteômica quantitativa dimetilação redutora (rotulagem Redi): reagentes baratos de rotulagem (reagentes custam menos de US $ 1 por amostra), a taxa de reação rápida (~ 10 min), ausência de produtos secundários, altas reprodutibilidade (Figuras 3, 4), produtos de reacção estáveis, capacidade de usar qualquer protease, e alta eficiência de ionização de peptídeos identificados. Marca...

Medindo diferenças de concentração de muitas proteínas entre as amostras complexas é um desafio central em proteômica. Cada vez mais, isso é feito através da marcação de proteínas de cada uma das amostras com diferentes marcações isotópicas, combinando as amostras, e por espectrometria de massa para quantificar as diferenças de concentração. Existem vários métodos para a marcação isotópica estável de proteínas e peptídeos. 15N rotulagem 1 e 2 SILAC introduzir marcadores isotópicos metabolicamente in vivo, ao passo que iCAT 3, iTRAQ 4, e redução dimetilação 5 adicionar tags de isótopos estáveis ​​após a extracção de proteína e de digestão. Entre esses métodos, dimetilação redutora (rotulagem Redi) está ganhando popularidade como um método barato e reprodutível para quantificar as diferenças de concentração de proteínas em quase qualquer tipo de amostra. Rotulagem Redi envolve péptidos que reagem com o formaldeído, para formar uma base de Schiff, a qual é então reduzidapor cianoborohidreto. Esta reacção dimethylates grupos amino livres no terminal N e cadeias laterais de lisina e monomethylates prolinas N-terminais. O protocolo aqui descrito metila péptidos em amostra 1 com um rótulo de &quot;luz&quot; usando reagentes com átomos de hidrogénio na sua distribuição isotópica natural e a amostra 2, com um rótulo &quot;pesada&quot; usando formaldeído deuterado e cianoborohidreto (Figura 1). Cada grupo amino dimetilado sobre um péptido resulta numa diferença de massa de 6,0377 Da entre luz e formas, pesados, que são utilizados para distinguir entre as duas formas, utilizando um espectrómetro de massa. Especificamente, as abundâncias relativas de péptidos são quantificadas como a razão entre as áreas de cromatogramas de iões MS1 extraídos (MS1 razão de área de pico) da luz e da versão pesada para cada par de iões de péptidos. A abundância relativa de uma proteína é calculada como a razão da área do pico MS1 média entre todos os péptidos da proteína. Neste relatório, nós descrevemos um protocolo robusto para condutaing Redi experiências de marcação por LC-MS/MS, que inclui o péptido de extracção de fase reversa em fase sólida, marcação Redi na coluna, o péptido de fraccionamento por pH básico de fase reversa (BPRP) cromatografia, e purificação de misturas de péptidos utilizando StageTips (Figura 2) . Discutimos vantagens e limitações do uso de rotulagem Redi para proteômica quantitativa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="973">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">trichloroacetic acid</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T9159</td>
			<td style="width:319px;">protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">650501</td>
			<td>protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71736</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">S8045</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">43816</td>
			<td>denature, reduce, alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">protease Inhibitor Complete Mini Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693124001</td>
			<td>denature, reduce protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6125</td>
			<td>alkylate protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">H7523</td>
			<td>resuspend, extract, label protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">C5670</td>
			<td>resuspend protein</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:377px;">Lysyl Endoprotease</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td style="width:136px;">129-02541</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:136px;">V5111</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">320099</td>
			<td>protein digestion</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">tC18 Sep-Pak C18 cartridges</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT054960</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">extraction manifold</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT200609</td>
			<td>Reversed-phase peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">14261</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cyanoborohydride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">71435</td>
			<td>&#8220;light&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">deuterated formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>492620</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium cyanoborodeuteride</td>
			<td>CDN isotopes</td>
			<td style="width:136px;">D-1797</td>
			<td>&#8220;heavy&#8221; peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>peptide labeling</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 &#181;m particle size)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td style="width:136px;">770450-902</td>
			<td>basic pH reversed-phase chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">399388</td>
			<td>various</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">C18 Empore Disks</td>
			<td>3M</td>
			<td style="width:136px;">14-386-3&#160;</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">494437</td>
			<td>STAGE tips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative proteomics using reductive dimethylation for stable isotope labeling

Rotulagem isótopo estável de péptidos por dimetilação redutiva (marcação Redi) é um método para quantificar com precisão as diferenças entre as amostras de expressão de proteínas utilizando espectrometria de massa. Rotulagem Redi é realizada usando regular (luz) ou deuterados formas (pesados) de formaldeído e sódio cianoborohidreto para adicionar dois grupos metil para cada amina livre. Aqui demonstramos um protocolo robusto para a rotulagem Redi e comparação quantitativa de misturas complexas de proteínas. As amostras de proteínas para comparação são digeridas em péptidos, rotuladas para transportar a luz ou etiquetas de metilo pesados, misturados, e co-analisados ​​por LC-MS/MS. Abundância relativa de proteína são quantificados por comparação de áreas de pico do cromatograma de iões de versões marcadas pesadas e leves do péptido constituinte extraído da MS espectro completo. O método descrito aqui inclui a preparação de amostras por extração em fase sólida de fase reversa, Redi rotulagem na coluna de peptídeos, peptídeos fracionamento por rev básico pHfase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip purificação peptídica. Discutimos vantagens e limitações de rotulagem Redi em relação a outros métodos de incorporação de isótopos estáveis. Destacamos novas aplicações usando rotulagem Redi como um método rápido, barato e preciso para comparar a abundância de proteínas em quase qualquer tipo de amostra.

Avaliou-se a exatidão, precisão e reprodutibilidade de rotulagem Redi usando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisados ​​de células inteiras. Primeiro, quantificou o Redi eficiência de marcação de uma mistura de C. phytofermentans lisados ​​de proteína a partir de celulose (pesado marcado, H) e glicose (rótulo de luz, L) culturas. Quando filtrada para uma taxa de falsa descoberta peptídeo 1%, esta amostra continha 11.194 sequências de peptídeos exclusivo...

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Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

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