Name: reconstitution of &#946;-catenin degradation in xenopus egg extract
Uploaded: 2014-06-17T20:30:00
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Wir danken Laurie Lee für das kritische Lesen des Manuskripts. TWC wird von einem American Heart Association Promotionsstipendium (12PRE6590007) unterstützt. MRB wird von einem National Cancer Institute Ausbildungsförderung (T32 CA119925) unterstützt. SSH ist National Institutes of Health (R01DK078640) unterstützt. EL wird von den National Institutes of Health (R01GM081635 und R01GM103926) unterstützt.

1. Vorbereitung der Xenopus-Ei-Extrakt HINWEIS: Jeder Frosch ergibt etwa 1 ml der verwendbaren Ei-Extrakt. Extrakte aus 10 Frösche werden typischerweise zu einer Zeit hergestellt wird, und das Volumen der unten beschriebenen Puffer zur Durchführung einer 10 Frosches Xenopus-Ei-Extrakt prep. Das Puffervolumen kann somit für größere oder kleinere Zubereitungen von Ei-Extrakt eingestellt werden. Preps auf diese Weise erzeugte Proteinkonzentrationen konsequent ergeben ≥ 50...

<ol>
	<li>Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+is+degraded+by+the+ubiquitin+pathway.">Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway.</a> Nature. 349, 132-138 (1991).</li><li>Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+beta-catenin+stability:+reconstitution+of+the+cytoplasmic+steps+of+the+wnt+pathway+in+Xenopus+egg+extracts.">Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).</li><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+extracts.">Cell cycle extracts.</a> Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).</li><li>Dabauvalle, M. C., Scheer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+nuclear+pore+complexes+in+Xenopus+egg+extract.">Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract.</a> Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+profilin+in+the+actin-based+motility+of+L.+monocytogenes+in+cells+and+in+cell-free+extracts.">Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts.</a> Cell. 76, 505-517 (1994).</li><li>Maresca, T. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+APC+and+Axin+derived+from+experimental+and+theoretical+analysis+of+the+Wnt+pathway.">The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway.</a> PLoS Biology. 1, (2003).</li><li>Seeling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+beta-catenin+signaling+by+the+B56+subunit+of+protein+phosphatase+2A.">Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A.</a> Science. 283, 2089-2091 (1999).</li><li>Guger, K. A., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Catenin+has+Wnt-like+activity+and+mimics+the+Nieuwkoop+signaling+center+in+Xenopus+dorsal-ventral+patterning.">beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning.</a> Dev Biol. 172, 115-125 (1995).</li><li>Cselenyi, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP6+transduces+a+canonical+Wnt+signal+independently+of+Axin+degradation+by+inhibiting+GSK3's+phosphorylation+of+&#946;-catenin.">LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of &#946;-catenin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).</li><li>Jernigan, K. 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K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females.">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+fractionation+of+Xenopus+laevis+egg+extracts.">Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+DNA+damage+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+small+molecule+inhibitors+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway+in+Xenopus+egg+extracts.">Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts.</a> Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).</li><li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes.">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li><li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells.">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li></ol>

Xenopus-Ei-Extrakt ist ein robustes System für die Untersuchung von biochemischen β-Catenin-Umsatzes. Die Konzentration von β-Catenin in Xenopus-Ei-Extrakt 25 ~ 2 nM. Unter optimalen Bedingungen ist die Ei-Extrakt, der zum Abbau β-Catenin mit einer Geschwindigkeit von 50-100 Nm / h und ist halb-maximal bei 200 nM 24. Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche Wiederherstellung der β-Catenin-Abbau unter Verwendung von Xenopus-Ei-Extrakt. Dazu gehören 1)...

Xenopus laevis-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um viele Zell biologischen Prozessen einschließlich Zytoskeletts, Kernanordnung und Import, Apoptose, Ubiquitin-Stoffwechsel, Zellzyklus-Progression, Signaltransduktion und Proteinumsatz 1-17 studieren. Die Xenopus-Ei-Extrakt-System ist offen für die biochemische Analyse einer Legion von zellulären Prozessen, weil Ei-Extrakt stellt im Wesentlichen unverdünnt Zytoplasma, die alle wesentlichen Komponenten zytoplasmatischen notwendig, diese Prozesse auszuführen und ermöglichen Untersuchung enthält. Große Mengen von Ei-Extrakt kann auf einmal zur biochemischen Manipulationen, die große Mengen von Material (z. B. Proteinreinigung oder Hochdurchsatz-Screening) 18-20 erfordern, hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Konzentration von spezifischen Proteinen in Xenopus-Ei-Extrakt kann präzise durch Zugabe von rekombinantem Protein und / oder der Immunodepletion ENDOG eingestellt werdenenous Proteine ​​im Gegensatz zur Transfektion von Plasmid-DNA, wobei die Expression des Proteins von Interesse ist schwierig zu steuern. Darüber hinaus kann der Mangel an verfügbaren rekombinanten Proteinen durch die Zugabe von Transkripten, die das Protein von Interesse kodiert, überwunden werden, unter Ausnutzung der hohen Kapazität der frisch hergestellten Xenopus-Ei-Extrakt zur exogen zuge mRNA zu übersetzen. Die Regulation der Proteinabbau ist entscheidend für die Steuerung vieler zelluläre Wege und Prozesse 21. Xenopus-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um den Proteinabbau zu untersuchen, wie das System erlaubt mehrere Möglichkeiten, um den Proteinumsatz ohne verwirrende Einflüsse der Transkription und Translation kontrollieren. Der Wnt-Signalweg ist eine hoch konservierte Signalweg, der eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Krankheit spielt. Der Umsatz von β-Catenin, der Haupt Effektor des Wnt-Signalwegs, ist stark reguliert, und eine erhöhte Steady-State-level von β-Catenin ist entscheidend für die Aktivierung der Wnt-Zielgene. Die Bedeutung der β-Catenin-Abbau wird durch die Tatsache, dass Mutationen im Wnt-Signalweg, die β-Catenin-Abbau hemmen, gefunden in ~ 90% der sporadischen Fälle von Darmkrebs 22 hervorgehoben. β-Catenin-Abbau durch Komponenten des Wnt-Signalwegs getreu in Xenopus-Ei-Extrakt rekapituliert, um den Mechanismus des Umsatzes zu studieren sowie neuartiger niedermolekularer Modulatoren von seiner Abbau 2, 19, 20, 23-29 zu identifizieren. Verfahren zur Herstellung von Xenopus-Ei-Extrakt zur Untersuchung der Zellzyklus sind in früheren Veröffentlichungen JoVE 30-32 beschrieben. Das derzeitige Protokoll beschreibt eine Modifikation dieser Verfahren und ist für den Abbau von optimierten [35 S]-radioaktiv markierten β-Catenin und die Luciferase-markierten β-Catenin inXenopus-Ei-Extrakt. Das radioaktiv markierte Abbau-Assay ermöglicht die direkte Visualisierung von Protein-Ebene über Autoradiographie. [35 S]-Methionin in das Protein von Interesse unter Verwendung eines in vitro-Translationsreaktion, die dann direkt auf eine Abbaureaktion zugegeben werden kann, eingebaut. Darüber hinaus ist das radioaktiv markierte Proteinumsatz-Assay erfordern einen Antikörper gegen das Protein von Interesse oder ein Epitop-Tag, das die Proteinstabilität beeinflussen. Da selbst kleine Veränderungen in der Proteinniveaus, wie in Änderungen der Intensität des radioaktiv markierten Proteinbande reflektiert, werden leicht durch Autoradiographie sichtbar gemacht, die [35 S]-radioaktiv markierte Abbauassay stellt ein sehr nützliches Verfahren zur Visualisierung des Proteinumsatzes 2. Fusion von β-Catenin an Leuchtkäfer-Luciferase (im folgenden einfach als &quot;Luciferase&quot; genannt) ermöglicht eine genaue und einfache quantitative Messung der Proteinspiegel, umum die kinetischen Eigenschaften der β-Catenin-Umsatz 19, 20 zu bestimmen. Ein wesentlicher Vorteil der Luciferase-Assay ist, dass es eine starke quantitative System, in dem bis skaliert wird. Das folgende Protokoll bietet einfache Methoden zur Bestimmung von β-Catenin-Abbau und eine robuste, effiziente und effektive Methode für die Hochdurchsatz-Screening von neuen β-Catenin-Modulatoren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:709px;" width="710">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Material</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:243px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td style="width:132px;">ProSpec</td>
			<td style="width:119px;">hor-272-A</td>
			<td>Reconstituted with distilled water before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG10-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">S23020-5000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC42352-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:132px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cysteine</td>
			<td style="width:132px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC17360-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Leupeptin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L2884-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aprotinin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1153-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pepstatin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4265-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C8273-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe: Luer Lock tip</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">27G1 needle</td>
			<td style="width:132px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed</td>
			<td style="width:132px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Steady-Glo Luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2520</td>
			<td>Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L4600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">L3260</td>
			<td>Generally higher yield than reticulocyte lysate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35]</td>
			<td style="width:132px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEG772007MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">27920-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Creatine phosphokinase</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3755-35KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dual-Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:132px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2920</td>
			<td>Same storage conditions as Steady-Glo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL Centrifuge tubes</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0556214D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall SS-34 fixed angle rotor</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">115 V 50/60 Hz Minicentrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-090-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mMessage mMachine Sp6 kit</td>
			<td style="width:132px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Firefly Luciferase antibody</td>
			<td style="width:132px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab16466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-GSK3 antibody</td>
			<td style="width:132px;">BD Transduction Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">610201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FLUOStar Optima</td>
			<td style="width:132px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sorvall RC-6 Plus Centrifuge</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">16&#176;C Incubator</td>
			<td style="width:132px;">Percival Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of &#946;-catenin degradation in xenopus egg extract

Xenopus laevis-Ei-Extrakt ist eine gut charakterisierte, robustes System zur Untersuchung der Biochemie der verschiedenen zellulären Prozessen. Xenopus-Ei-Extrakt verwendet wurde, um den Proteinumsatz in vielen zellulären Kontexten, einschließlich des Zellzyklus und der Signalübertragungswege 1-3 studieren. Hierin wird ein Verfahren zur Isolierung von Xenopus-Ei-Extrakt, das optimiert wurde, um die Verschlechterung der kritischen Wnt-Komponente, β-Catenin fördert beschrieben. Zwei verschiedene Verfahren werden beschrieben, um β-Catenin Proteinabbau in Xenopus-Ei-Extrakt zu beurteilen. Ein Verfahren ist visuell aussage ([35 S]-radioaktiv markierte Proteine), während das andere leichter für Hochdurchsatz-Assays (Firefly-Luciferase-markierte Fusionsproteine) skaliert. Die beschriebenen Techniken können dazu verwendet werden, ein, sind aber nicht darauf beschränkt, zu beurteilen β-Catenin-Protein zu identifizieren und Umsatz molekularen Komponenten beiträgt, den Umsatz. Zusätzlich wird die Fähigkeit, um große Mengen von homogenen Xenopus-Ei-Extrakt in Kombination mit der quantitativen und einfache Auslesung der Luciferase-markierte Proteine ​​zu reinigen, ermöglicht dieses System leicht für Hochdurchsatz-Screening auf Modulatoren von β-Catenin Abbau angepasst werden.

Eine schematische Darstellung des β-Catenin-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt ist in 2A gezeigt. 35 S-markierten β-Catenin wurde in Xenopus-Ei-Extrakt inkubiert wurden Aliquots (1 ml Extrakt Äquivalent) zu den entsprechenden Zeiten entnommen und die Proben wurden einer SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie. β-Catenin Abbau von Komponenten des Wnt-Signalwegs durch das Ubiquitin-Proteasom-System 2 vermittelt wird, und den Abbau von [35 S]-radioaktiv markie...

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Reconstitution Of ÃƒÅ½Ã‚Â²-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Es wird ein Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau unter Verwendung radioaktiv markiert und die Luciferase-Fusionsproteine ​​in Xenopus-Ei-Extrakt und deren Anpassung für Hochdurchsatz-Screening für Kleinmolekül-Modulatoren der Proteinabbaus beschrieben.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

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Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Unit 1

Translation: RNA to Protein

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Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Forschung

Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

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Gesichtstransplantation in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

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Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

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Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

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Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

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