Name: rnascope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma at JoVE.com

معتمدة في جزء من منحة المعاهد الوطنية للصحة (R43/44CA122444) ومنحة وزارة الدفاع BRCP (W81XWH-06-1-0682) لYL.

1. العينة، معدات، وإعداد الكاشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع عينة الأنسجة إلى كتل من 3-4 مم في السمك، وإصلاح في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة جديدة ل16-32 ساعة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) وتغرس في البارافين. قطع FFPE إلى أقسام من 5 ± 1 ميكرومتر سمك من كتل FFPE، جبل أقسام على الشرائح والهواء الجاف. ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة تحت جفاف لمدة تصل إلى 3 أشهر. وينبغي خبز الشرائح الأنسجة التي شنت في منطقة جافة في أكثر من 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة قبل الفحص RNAscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب فرن التهجين إلى 40 درجة مئوية. وضع ورقة الترطيب في علبة التحكم في الرطوبة. إضافة 50 مل درهم 2 O إلى ورقة الترطيب لتبلل تماما. إدراج صينية مغطاة في فرن لprewarm لا يقل عن 30 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 700 مل 1X يمهد للمعالجة 2 الحل (10 نيكولا لانغ، ودرجة الحموضة 6 سيترات عازلة) عن طريق تمييع الحل 10X المعالجة في DH 2 O. تسخين 1X يمهد للمعالجة 2 الحل لتغلي ومايntain درجة الحرارة بين 100-104 درجة مئوية في حين منع الإفراط في الغليان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم 3 L 1X الاحتياطي اغسل (0.1X SSC) عن طريق تمييع prewarmed 50X الاحتياطي اغسل في DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2 × 200 مل من الزيلين و2 × 200 مل من 100٪ ETOH لdeparaffinization تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 50٪ الهيماتوكسيلين حل تلطيخ وكاشف الصبغة الزرقاء (0.01٪ ماء النشادر) لتلطيخ آخر تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 200 مل من الزيلين، 200 مل من 70٪، و 2 × 200 مل من 100٪ ETOH للجفاف تحت غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقيقات Prewarm الهدف عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وتقديم كشف RTU كيت كاشف لدرجة حرارة الغرفة، بما في ذلك RTU Amp1، Amp2، AMP3، Amp4، الأمبير 5 براون، وAmp6 براون، باستثناء DAB مولد اللون براون-A-B وبراون . </li></ol> 2. RNAscope الفحص Deparaffinization والجفاف بعد الخبز، deparaffinize أقسام الأنسجة في الزيلين ل2 × 5 دقائق مع الانفعالات المتكررة، ويذوىفي 100٪ ETOH ل2 × 3 دقيقة مع التحريض المتكرر. الهواء الجاف لمدة 5 دقائق ورسم حاجز مسعور حول القسم الأنسجة مع مسعور الحاجز القلم. المعالجة المسبقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أقسام الأنسجة مع يمهد للمعالجة 1 لمدة 10 دقيقة في RT لتبريد النشاط البيروكسيديز الذاتية، وشطف في DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أقسام الأنسجة مع يمهد للمعالجة 2 الحفاظ على درجة حرارة الغليان لمدة 15 دقيقة لاسترجاع الحمض النووي الريبي، وشطف مرتين في DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أقسام الأنسجة مع يمهد للمعالجة 3 لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية لمدة الهضم من البروتين في الفرن HybEZ، وشطف مرتين في DH 2 O. </li></ol> هدف التحقيق التهجين وتشمل تحقيقات الهدف HPV-HR 7 بركة: HPV16، 18، 31، 33، 35، 52، و 58. إضافة تحقيقات فيروس الورم الحليمي البشري، اليوبيكويتين C (UBC) والبكتيرية تحقيقات dapB الجين بشكل منفصل على ثلاثة أقسام الأنسجة مجاور. هجن عند 40 درجة مئوية في الفرن لمدة 2ساعة، ثم يشطف في 1X العازلة للغسل 2 × 2 دقيقة في RT. إشارة التضخيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أقسام الأنسجة مع Amp1 (المضخم) لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية، Amp2 (المخفض الخلفية) لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية، AMP3 (مكبر للصوت) لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية، وAmp4 (التحقيق التسمية) لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية في فرن HybEZ. بعد كل خطوة التهجين، وشطف في 1X العازلة للغسل 2 × 2 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أقسام الأنسجة مع Amp5 لمدة 30 دقيقة وAmp6 لمدة 15 دقيقة في RT. بعد كل خطوة الحضانة، شطف في 1X العازلة للغسل 2 × 2 دقيقة في RT. </li></ol> الكشف عن إشارة احتضان أقسام الأنسجة مع خليط 1:01 DAB عن طريق خلط حجم مساو من براون-A-B وبراون لمدة 10 دقيقة في RT، وشطف مرتين في DH 2 O. Counterstaining <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; أقسام الأنسجة وصمة عار مع 50٪ الهيماتوكسيلين الحل لمدة 2 دقيقة في RT، وشطف مع DH 2 O حتى الشرائح واضحة في حين تبقى الأنسجة الأرجواني. تراجع الشرائح في 0.01٪ الأمونيا في DH 2 O ل5X وتبع مع ​​5 الانخفاضات في DH 2 O. تركيب شريحة يذوى أقسام الأنسجة في 70٪، 100٪، 100٪ وETOH لمدة 2 دقيقة لكل منهما، الزيلين لمدة 5 دقائق، مع وسائل الاعلام جبل تصاعد القائم على الزيلين.

<ol>
	<li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002.">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li><li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States.">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen.">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+regulation+of+NRG1+isoform+expression+by+neuronal+activity.">Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity.</a> J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).</li><li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations.">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).</li><li>Payne, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+circulating+tumour+cell+detection+using+multiplex+RNA+in+situ+hybridisation+predicts+progression-free+survival+in+metastatic+breast+cancer+patients.">Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients.</a> Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).</li><li>Bordeaux, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+situ+measurement+of+estrogen+receptor+mRNA+predicts+response+to+tamoxifen.">Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen.</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantitative+RNA+in+situ+hybridization+for+resolution+of+equivocal+and+heterogeneous+ERBB2+(HER2)+status+in+invasive+breast+carcinoma.">Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma.</a> J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).</li><li>Tubbs, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders.">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li><li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-risk+human+papillomavirus+E6/E7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal/hypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization.">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma:+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status.">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization+method.">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Schache AG, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li><li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck:+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus.">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li><li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials.">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer+(unabridged+version).">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version).</a> Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).</li></ol>

ويعمل كل من الكتاب من قبل والأسهم في تشخيص ادفانسد سيل، وشركة الخاصة

وفيروس الورم الحليمي البشري RNAscope مقايسة يسمح التصور المباشر من E6/E7 مرنا في الموقع في فيروس الورم الحليمي البشري المرتبطة الرأس والرقبة وسرطان الخلايا الحرشفية. مقايسة RNAscope متوافقة تماما مع أنسجة الورم بشكل روتيني ثابت ويحافظ على مورفولوجيا الأنسجة لالارتباطات التشريحية المرضية (الشكل 2). والميزة الرئيسية للمقايسة RNAscope على الطرق التقليدية CISH هو أنه يزيد على وجه التحديد إشارات التهجين (أرقام 2B و2E) دون تضخيم الضوضاء في الخلفية (أرقام 2C و2F). في الممارسة العملية، ويمكن الانتهاء من إجراءات الفحص RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري في غضون 8 ساعة أو مريح تنقسم على مدى يومين. وقد استخدم RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري فحص لتحديد حالة فيروس الورم الحليمي البشري في الرأس والرقبة وسرطان الخلايا الحرشفية 12-16، مما يدل على حساسية 97٪ و 93٪ خصوصية باستخدام QRT-PCR كطريقة مرجع 16. مركز حقوق الإنسان التقليديةISH omogenic لHR-فيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي هو محددة للغاية ولكن لديه حساسية ~ 80٪ 12. المناعى (IHC) لتلطيخ الخلوية بديلة علامة P16 يوضح حساسية ممتازة ولكن قد يولد نتائج إيجابية كاذبة 15،18، وخاصة في nonoropharyngeal سرطانات الرأس والعنق 15. &quot;المعيار الذهبي&quot; الطريقة الحالية لQRT-PCR لفيروس الورم الحليمي البشري E6/E7 مرنا يتطلب الكشف الأنسجة الطازجة المجمدة لأفضل النتائج ومعقد من الناحية التقنية، الأمر الذي يحد من استخدامه لمختبر أبحاث فقط. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يتطلب استخراج الحمض النووي الريبي الذي يجعل من المستحيل لربط HR-HPV E6/E7 مرنا التعبير مع التشريح المرضي. هناك العديد من العوامل الحاسمة لنجاح الفحص RNAscope. الأولى، للحصول على أفضل النتائج، ينبغي أن تكون ثابتة الأنسجة في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة الطازجة في درجة حرارة الغرفة ل16-32 ساعة وفقا لمبادئ توجيهية ASCO / CAP 19. الثاني، ينصح بشدة الفرن HybEZ منذ ذلك تمكينق التحكم الأمثل لدرجة الحرارة والرطوبة لتهجين التحقيق وإشارة الخطوات التضخيم. ثالثا، من المهم أن إزالة مخازن المتبقية الزائدة قبل كل خطوة ولكن لا تزال تبقي على قسم الأنسجة من خلال تجفيف أي من هذه الخطوات. الإجراء RNAscope دليل الموصوفة هنا تم مؤتمتة بالكامل على شريحة نظام لصناعة السيارات في تلطيخ التجارية 10. وهذا ينبغي أن يسهل إلى حد كبير توحيد شروط الفحص وتوفير العمالة اليدوية الثمينة في مختبرات علم الأمراض السريرية. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير برنامج تحليل الصور مكرسة 10 لتحديد الخلايا وإشارات تلطيخ على شريحة رقمية، والتي ينبغي أن تساعد على التخلص من الذاتية وتحسين استنساخ في التهديف تلقائيا. باختصار، بالكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري RNAscope فحص وجود محاضر HR-HPV E6/E7 مرنا في الموقع في الأنسجة FFPE. أنه يحتوي على سير العمل التي هي مألوفة لعلم الأمراض السريرية مختبرالمحافظين من خلال السماح التصور مباشرة من هذه الفروع في الأنسجة. أنه يوفر منصة مثالية لدراسة (FFPE) عينات الأنسجة، ويمكن اعتمادها بسهولة من قبل مختبرات علم الأمراض التشخيص.

حسابات فيروس الورم الحليمي البشري المعرضة للخطر (HR-HPV) إصابة ما يقرب من 5٪ من جميع حالات السرطان في جميع أنحاء العالم 1. وزادت حالات الإصابة بسرطان الفم والبلعوم المرتبط فيروس الورم الحليمي البشري خلال العقود الماضية، وخاصة بين الرجال. والفم والبلعوم وسرطان الخلايا الحرشفية، فيروس الورم الحليمي البشري الإيجابية (OPSCC) تشكل أغلبية الأرجح من جميع سرطانات الرأس والعنق في الولايات المتحدة في 20 سنوات القادمة 2. وترتبط الفم والبلعوم سرطان الخلايا الحرشفية الناجمة عن فيروس الورم الحليمي البشري مع بقاء مواتية، وحالة الورم فيروس الورم الحليمي البشري هو عامل النذير قوية ومستقلة من أجل البقاء 3. ويعتبر الدليل على تفعيل النسخي من الجينات المسرطنة الفيروسي E6 E7 وكمعيار الذهب لوجود فيروس الورم الحليمي البشري ذات الصلة سريريا 4. ومع ذلك، والكشف عن E6/E7 مرنا من أنسجة الورم الطازجة بواسطة تقنية RT-PCR ليس من العملي في الممارسة السريرية الروتينية، وقد تقتصر على مختبرات الأبحاث. في الآونة الأخيرة، ونحن هفوضعت ه رواية تكنولوجيا الحمض النووي الريبي ISH دعا RNAscope، والتي تمكن الكشف متعددة في الخلايا الفردية مع واحدة RNA حساسية جزيء في الفورمالين الثابتة عينات الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) 5-10. قدمنا ​​ثلاثة خطوط من الأدلة لكشف جزيء واحد 5. الأول، وتصميم وإشارة RNAscope التحقيق نظام التضخيم يسمح الكشف عن نسخة واحدة HER2 أهداف الحمض النووي الجيني في هيلا وSK-BR-3 خطوط الخلايا. الثاني، بالمقارنة مع HER2 إشارات الحمض النووي الجيني، وكان توزيع شدة الفلورسنت من النقاط إشارة HER2 مرنا في خلايا هيلا يتفق مع جزيء واحد لكل نقطة. ثالثا، عدد HER2 مرنا النقاط إشارة لكل خلية المتطابقة عن كثب في عدد النسخ HER2 مرنا قدر من قبل مقايسة الكمي القائم على الحل، مما يدعم الكشف عن جزيء واحد. علاوة على ذلك، counterstaining من نوى مع دابي في المجهر الفلورسنت أو مع الهيماتوكسيلين في المجهر مشرق الميدان يسمح التصور من النوى الفردية، ذوي الخوذات البيضاءمعنوى بدوره يسمح الكشف النوعي والكمي لأهداف RNA على أساس وحيدة الخلية 10. القدرة على تحليل التعبير الجيني في الموقع في العينات السريرية الروتينية يجعل RNAscope منصة واعدة لأمراض التشخيص، وخاصة تلك المستندة إلى قسم المقايسات الأنسجة FFPE 10،11. قمنا بتطوير فيروس الورم الحليمي البشري مقايسة على أساس RNAscope للكشف عن E6/E7 مرنا من سبعة أنماط جينية عالية الخطورة فيروس الورم الحليمي البشري (HPV16، 18، 31، 33، 35، 52، و 58) باستخدام مجموعة من تحقيقات النمط الجيني محددة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة لدينا في OPSCC أن RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري فحص حساس للغاية ومحددة في تحديد حالة فيروس الورم الحليمي البشري على أنسجة FFPE 12-17، وأيضا بإعلام التكهن في OPSCC 12،16. مبدأ التكنولوجيا RNAscope وقد وصفت سابقا 5. هنا، نحن تصف كاملة بروتوكول RNAscope فحص وتثبت استخدامه في الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري في HR-FFPE الورم أقسام الأنسجة.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:145px;">SuperFrost Plus slides</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-550-15</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">HybEZ Oven, Tray, and Rack</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310011, 310012, 310014</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310035</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:145px;">RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">312351</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:145px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:145px;">Vector Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">H-4000</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">100% EtOH</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">ALREAGAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Xylene&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">X3P-1GAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">HXGHE1LT</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Ammonia hydroxide</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">320145-500mL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Cover Glass 24x50 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-545-F</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Hot Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">11-300-49SHP</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Drying Oven</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 60 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Water Bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 40 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnascope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma

&quot;المعيار الذهبي&quot; للكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري أنكجنيك هو مظاهرة النشطة transcriptionally فيروس الورم الحليمي البشري المعرضة للخطر في أنسجة الورم. ومع ذلك، والكشف عن E6/E7 مرنا بواسطة الكمي عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR) يتطلب استخراج الحمض النووي الريبي الذي يدمر سياق نسيج الورم حاسم لعلاقة شكلية وكان من الصعب أن تعتمد في الممارسة السريرية الروتينية. لدينا الحمض النووي الريبي وضعت مؤخرا التكنولوجيا الموقع التهجين، RNAscope في، يسمح التصور المباشر من الحمض النووي الريبي في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) مع حساسية الأنسجة جزيء واحد وقرار وحيد الخلية، والتي تمكن حساسة للغاية ومحددة تحليل الوضع الطبيعي في أي الحمض النووي الريبي في العلامات البيولوجية في العينات السريرية الروتينية. تم تصميم RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري فحص للكشف عن E6/E7 مرنا من سبعة عالية المخاطر فيروس الورم الحليمي البشري المورثات (HPV16، 18، 31، 33، 35، 52، و 58) باستخدام مجموعة من تحقيقات النمط الجيني محددة. وقد أثبتت أنها حساسية ممتازةوالتحديد ضد الطريقة الحالية &quot;المعيار الذهبي&quot; للكشف عن E6/E7 مرنا بواسطة QRT-PCR. حالة فيروس الورم الحليمي البشري التي تحددها RNAscope هو النذير بشدة من النتائج السريرية لدى مرضى سرطان الفم والبلعوم.

RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري فحص سير العمل مقايسة RNAscope ديه تبسيط العمل للغاية مشابه لIHC (الشكل 1). وتتكون من أربع خطوات رئيسية: المعالجة المسبقة، التهجين، التكبير إشارة، والكشف. أنها توظف استراتيجية فريدة من نوعها تصميم المسبار الذي يضمن الدقة العالية إشارة التضخيم 5. في RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري الفحص، يتم تجميع سبعة مجموعات التحقيق HR-فيروس الورم الحليمي البشري، وكلها معترف بها من قبل نفس النظام تضخيم الإشارات المرتبطة البيروكسيداز الفجل (HRP). تم الكشف عن إشارات التهجين محددة رواسب البني شكلتها HRP حفز رد فعل مولد اللون باستخدام DAB كما الركيزة، التي يمكن تصور بسهولة عن طريق معيار المجهر حقل مشرق. تلطيخ ممثل للكشف فيروس الورم الحليمي البشري ويبين الشكل 2 المثال الصور من أقسام FFPE الملون الرأس والرقبة وسرطان الخلايا الحرشفية. في حالة فيروس الورم الحليمي البشري الإيجابية (الشكللدى عودتهم 2A)، الكشف عن تحقيقات HR-HPV إشارات قوية منقط تحديدا في الخلايا السرطانية. التحقيق UBC الكشف عن العديد من الإشارات حشوية منقط في كل من الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية (الشكل 2B). أظهرت البكتيرية التحقيق dapB الجين خلفية نظيفة (الشكل 2C). في حالة فيروس الورم الحليمي البشري السلبية، سواء التحقيق HR-فيروس الورم الحليمي البشري والتحقيق dapB الكشف عن أي إشارات (أرقام 2D و 2F)، في حين تم الكشف عن إشارات قوية باستخدام مسبار UBC (الشكل 2E). في هذا الاختبار، ويعمل UBC السيطرة الإيجابية لتقييم نوعية الأنسجة والحمض النووي الريبي dapB عن السيطرة السلبية للإشارات الخلفية. وفيروس الورم الحليمي البشري لتحديد وضع التهديف ينطوي على دراسة جميع الشرائح الثلاث لكل حالة. ويستخدم مستوى تلطيخ على التحكم الشريحة السلبية (dapB) الشريحة كما قطع: يعرف الإيجابية فيروس الورم الحليمي البشري من خلال وجود هيولي منقط و / أو تلطيخ النووية التي كانت فوق إشارة على الشريحة dabpB. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> الشكل 1. انسيابي من RNAscope الفحص. توضيحات من RNAscope فحص سير العمل. يحتوي على فحص RNAscope 4 خطوات رئيسية، المعالجة المسبقة، التحقيق الهدف التهجين، تضخيم إشارة الكشف والإشارة. ويمكن الانتهاء من إجراءات الفحص كامل في 8 ساعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> الشكل 2. مثل الصور من الشرائح RNAscope الملون. أقسام FFPE ملطخة تحقيقات لHR-فيروس الورم الحليمي البشري، UBC (مراقبة إيجابية) وdapB (مراقبة سلبية)من حالتين HNSCC. AC. فيروس الورم الحليمي البشري الإيجابية القضية. A، HR-HPV E6/E7 مرنا التعبير في الخلايا السرطانية. أقحم، 40X التكبير لإظهار إشارات منقط. B و C) أقسام الأنسجة المجاورة تظهر تلطيخ إيجابية UBC (B) والسلبية لdapB (C)، على التوالي. DF) HPV السلبية القضية. D) لا تلطيخ لفيروس الورم الحليمي البشري E6/E7 مرنا ، على غرار سيطرة سلبية dapB (F). E) UBC تلطيخ إيجابية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a>

Watch this Scientific Journal Video about RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma at JoVE.com

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

RNAscope ل<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري بالموقع Transcriptionally في الرأس والرقبة سرطان الخلايا الحرشفية

ويرتبط وجود فيروس الورم الحليمي البشري المعرضة للخطر في الرأس والرقبة نسيج الورم مع تحقيق نتائج طيبة. الحمض النووي الريبي وضعت مؤخرا تقنية التهجين في الموقع يسمى RNAscope يسمح التصور المباشر لفيروس الورم الحليمي البشري E6/E7 مرنا في أقسام الأنسجة FFPE.

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Research

JoVE Journal

Medicine

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

متعدد الفوتون التصوير من غزو خلايا الورم في الفأر نموذج مثلي الفم سرطان الخلايا الحرشفية

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

الثقافة الأولية من الإنسان الدهليزي Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

ال<em&gt; في البيضة</em&gt; الفرخ مشيمائي غشاء (CAM) الفحص بمثابة طعم أجنبي نموذج فعال لسرطان الكبد

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

عزل وتوصيف من الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا حيوانية وجود الجذعية خصائص الخلية

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

النهج الخلفي نصف دائري قناة لإيصال الجينات الإذن الداخلية في الماوس الأطفال حديثي الولادة

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in MeniÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¨re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

في فيفو تحليل شكلي لاعصاب البشرية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي في سويندل للمرض آذان وآذان السمع العادي

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

الخنزير كنموذج تدريبي للتعمير ميكروفاسكولار الرأس والعنق

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

الفرخ الغشاء تشوريوالانTOك في نموذج فيفو لتقييم الغزو في ما قبل البعد العصبي في سرطان الرأس والرقبة

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

Learning Modern Laryngeal Surgery in a Dissection Laboratory

تعلم جراحة الحنجرة الحديثة في مختبر تشريح

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is ...

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

إعداد سقالات الكلى المزيلة في الفئران

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...