Name: lineage-reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neurons
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons at JoVE.com

Vi är tacksamma till Dr Magdalena Götz för hennes insatser under utvecklingen av detta protokoll. Vi tackar Dr Marius Wernig (Stanford University) för generöst ger oss den Sox2 kodande sekvensen. Vi är också mycket tacksamma till Dr Alexandra Lepier för virusproduktion. Detta arbete har finansierats med bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) och BMBF (01GN1009A) till BB, och den bayerska statliga ministeriet för Vetenskap, forskning och konst till MK och BBCS fått medel från den binationellt SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (tyska och slovenska federala ministerierna för utbildning och forskning) och DFG (SFB 824).

1. Isolering och odling av vuxen människa hjärnceller Försök med mänsklig vävnad bör utföras i enlighet med alla relevanta statliga och institutionella föreskrifter om användning av mänskligt material för forskningsändamål. Den nuvarande protokollet har utvecklats i enlighet med godkännande av den etiska kommittén vid medicinska fakulteten vid LMU München och skriftligt informerat samtycke från alla patienter. Detta protokoll för att förbereda k...

<ol>
	<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts.">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li><li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+water+deficit,+ABA,+and+provenances+in+Picea+asperata.">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons.">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li><li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells.">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells.">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li><li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level.">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li><li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts.">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li><li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo.">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li><li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts.">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li><li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons.">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts.">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li><li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+cells:+how+to+make+and+define+a+neuron.">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li><li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors.">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li><li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons.">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li><li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons.">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li><li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells.">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li><li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion.">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li><li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable,+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells.">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li></ol>

Den nuvarande protokollet beskriver expansionen in vitro och anrikning av pericyte-härledda celler efter isolering från den vuxna mänskliga hjärnbarken och den efterföljande omvandling till INS genom retrovirus-medierad uttryck för neurogen transkriptionsfaktorer Sox2 och Ascl1. Ett sådant protokoll ger en experimentell in vitro-system för att studera släktlinje-konvertering av hjärn bosatt celler i nervceller och potentiellt även glia, med målet i åtanke att slutligen översätta denna di...

I motsats till omprogrammering av somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), som i sin tur är utrustade med en uppsjö av differentieringspotentialer syftar direkt omprogrammering för rak omvandling av en specifik celltyp till en annan. När det gäller deras tillämpning i samband med sjukdomsmodellering och potentiella cellbaserade terapier, både omprogrammering tillvägagångssätt har specifika fördelar och nackdelar. Omprogrammering in iPSCs (i) ger en nästan oändlig källa av celler; (Ii) gör det möjligt för genteknik; (Iii) förser med en nästan obegränsad differentieringspotential. Emellertid stora olägenheter med iPSCs medföra risk för tumorigenicitet av de odifferentierade cellerna (teratom formation in vivo) och behovet av ex vivo-odling och för senare utplantering om dessa celler som skall användas för cellbaserade terapier. Omvänt är direkt härstamning-omprogrammering begränsas av lägre utbyte av de önskade cellernasom korrelerar direkt med antalet målceller i start befolkningen, men har den fördelen att härstamning-omprogrammerade celler, tycks uppvisa ingen tumörframkallande risk vid transplantation 1,2; dessutom kan direkt omprogrammering även uppnås på plats, det vill säga inom det organ där skulle behövas dessa celler och därmed undvika behovet av transplantation. Med detta i åtanke, har vårt labb eftersträvas möjligheten till härstamning-omprogrammering hjärn bosatt celler i Ins som en ny strategi för cellbaserade terapier för neurodegenerativa sjukdomar. Hjärn bosatt celler som kan potentiellt betraktas som cellulära mål för härstamning-omprogrammering omfattar olika typer av macroglia (astrocyter NG2 celler och oligodendrocyter), mikroglia och mikrokärlsassocierade celler (endotelceller och pericyter). Vi har utförligt studerat omprogrammering potential astroglia av cerebral cor in vitrotex för tidig postnatal möss 3-5. På jakt efter samma sätt lämpliga cellkällor för direkt släktlinje-omprogrammering i den vuxna mänskliga hjärnan, vi stött på en cellpopulation som framgångsrikt kan programmeras in i ins och uppvisar kännetecken pericyter. Här beskriver vi ett protokoll för hur man skörda dessa celler från vuxna mänskliga hjärnan biopsier, för att utöka och berika dessa celler in vitro, och slutligen lyckats programmera om en betydande del av dessa in vitro-expanderade celler (i storleksordningen 25-30%) i ins. Omprogrammering kan uppnås genom samtidig retrovirus-medierad samexpression av två transkriptionsfaktorer, Sox2 och ascl1. Dessa PdiNs befanns förvärva förmågan av repetitiva aktionspotential bränning och att fungera som synaptiska mål för andra nervceller som anger deras förmåga att integreras i neurala nätverk. Vår protokoll ger en enkel procedur för isolering och härstamning konvertering av vuxna mänskliga hjärnan pericyter i ins. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD140b-PE</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">558821</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD146-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MCA2141FT</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-CD13-FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">MVA1270A488T</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">anti-CD34-APC</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">560940</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-PDGFR&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:80px;">3169S</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-CD146</td>
			<td style="width:80px;">Abcam</td>
			<td style="width:80px;">Ab75769</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NG2</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5320</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-SMA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2547</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T8660</td>
			<td style="width:80px;">use 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-MAP2</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">M4403</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GFAP</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">G3893</td>
			<td style="width:80px;">use 1:600</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-GFP</td>
			<td style="width:80px;">Aves Labs</td>
			<td style="width:80px;">GFP 10-20</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-RFP</td>
			<td style="width:80px;">Chromotek</td>
			<td style="width:80px;">5F8</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-S100&#946;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">S2532</td>
			<td style="width:80px;">use 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">anti-NeuN</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">MAB377</td>
			<td style="width:80px;">use 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-GABA</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A2052</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-Calretinin</td>
			<td style="width:80px;">Millipore</td>
			<td style="width:80px;">AB5054</td>
			<td style="width:80px;">use 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">anti-vGluT1</td>
			<td style="width:80px;">SYnaptic SYstems</td>
			<td style="width:80px;">135511</td>
			<td style="width:80px;">use 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control FITC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">11-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control PE</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">12-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Rat IgG1 isotype control APC</td>
			<td style="width:80px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:80px;">17-4301-81</td>
			<td style="width:80px;">use 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">12605-010</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61965</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">B27 serum-free supplement</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">17504044</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">10106-169</td>
			<td style="width:80px;">perform heat inactivation by incubation at 56 &#176;C for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">15140122</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">24020-091</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="198">
			<td height="198" style="height:198px;width:80px;">Dulbecco&#39;s PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1&#215;; Invitrogen, cat. no. 14190)</td>
			<td style="width:80px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">14190</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">H3375</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P0899</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">PFA (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">P1648</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">A9418</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">T9284</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:80px;">DAPI (4&#8242;,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate</td>
			<td style="width:80px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:80px;">042M4005</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Aqua-Poly/Mount</td>
			<td style="width:80px;">Polysciences</td>
			<td style="width:80px;">18606-20</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Polypropylene round-bottom tubes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352063</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352235</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">24-well plates</td>
			<td style="width:80px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:80px;">5530305</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">75 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">658175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:80px;">25 cm2 culture flasks</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">690175</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Disposable pipettes 10 ml</td>
			<td style="width:80px;">Sarstedt</td>
			<td align="center" style="width:80px;">#########</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass Pasteur pipettes (150 mm)</td>
			<td style="width:80px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:80px;">FB50251</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Glass coverslips 12 mm diameter</td>
			<td style="width:80px;">Menzel</td>
			<td style="width:80px;">CB00120RA1</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Surgical disposable scalpels&#160;</td>
			<td style="width:80px;">B. Braun</td>
			<td style="width:80px;">5518083</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:80px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:80px;">633180</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Conical tubes 15ml</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">352095</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:80px;">Laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:80px;">Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes</td>
			<td style="width:80px;">Hettich Lab Technology</td>
			<td style="width:80px;">1406</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:80px;">Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Humified cell culture incubator</td>
			<td style="width:80px;">Eppendorf Galaxy 170R</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Wather bath at 37 &#176;C</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">FACSFlow sheath fluid&#160;</td>
			<td style="width:80px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:80px;">342003</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:80px;">Epifluorescence microscope BX61</td>
			<td style="width:80px;">Olympus</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:80px;">Confocal microscope LSM710</td>
			<td style="width:80px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage-reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neurons

Direkt härstamning-omprogrammering av icke-neuronala celler in inducerade nervceller (INS) kan ge insikter i de molekylära mekanismerna bakom neurogenes och möjliggöra nya strategier för in vitro-modellering eller reparera den sjuka hjärnan. Identifiera hjärnan bosatt icke-neuronala celltyper kan bli föremål för direkt omvandling till Ins kan medge att lansera en sådan strategi på plats, dvs inom den skadad hjärnvävnad. Här beskriver vi ett protokoll som utvecklats i ett försök att identifiera celler som härrör från den vuxna mänskliga hjärnan att uppfylla denna förutsättning. Detta protokoll omfattar: (1) odling av humana celler från hjärnbarken erhållet från adulta humana hjärnan biopsier; (2) expansion in vitro (cirka kräver 2-4 veckor) och karakterisering av kulturen genom immuncytokemi och flödescytometri; (3) anrikning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) med användning av anti-PDGF-receptor-β-och anti-CD146-antikroppar;(4) retrovirus-medierad transduktion med neurogen transkriptionsfaktorer Sox2 och ascl1; (5) och slutligen karakterisering av de resulterande pericyte-derived inducerade nervceller (PdiNs) genom immunocytokemi (14 dagar till 8 veckor efter retroviral transduktion). I detta skede kan Ins sonderas för sina elektriska egenskaper av patch-clamp inspelning. Protokollet ger en mycket reproducerbar förfarande för härstamning omvandling av hjärn hemvist pericyter i funktionella mänskliga ins in vitro.

Det första resultatet av detta protokoll efter att framgångsrikt inrättande av en kultur från ett prov av vuxen människa hjärnbarken består i att identifiera de cellulära sammansättning av kulturen. Immuncytokemi för celltyp specifika proteiner avslöjar en betydande grad av heterogenitet mellan kulturer som härrör från exemplar av olika patienter (Figur 1A). Såsom kvantifieras genom flödescytometri finns det alltid en väsentlig fraktion av celler som uttrycker PDGFRβ (i genomsnitt ~ 75...

Watch this Scientific Journal Video about Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons at JoVE.com

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Inriktning hjärn bosatt celler för direkt härstamning-omprogrammering ger nya perspektiv för hjärnans reparation. Här beskriver vi ett protokoll för hur man förbereder kulturer anrikade för hjärn bosatt pericyter från den vuxna människans hjärnbark och omvandla dessa till inducerade nervceller genom retrovirus-medierad uttryck av transkriptionsfaktorer Sox2 och Ascl1.

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Att studera integration av vuxna födda Neuroner

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen av Telencephalic glutamaterg nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Miljö modulation av antalet mitthjärnan dopaminneuroner i vuxna möss

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Härledning av vuxen människa fibroblaster och deras direkt omvandling till Expander neurala stamceller

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkla Generation av en hög avkastning kultur av inducerade nervceller från mänsklig vuxen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kortsiktiga fritt flytande segment kulturer från den vuxna mänskliga hjärnan

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Migration, Chemo-Attraction och Co-Kultur Analyser för humanstamcells-härledda endotelceller och GABAergic nervceller

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Erhålla mänskliga Microglia från Vuxna mänskliga hjärnvävnaden

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...