Name: investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק.

1. יצירת פלסמידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone cDNAs עבור כל חלבון של עניין לשני וקטורי pLuc וpYFP, ​​תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות (איור 1). לפרוטוקולים מפורטים רואה הירוק ואח&#39; 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ?...

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li><li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening.">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li><li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+ubiquitination+in+living+cells+by+BRET.">Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET.</a> Nat Methods. 1, 203-208 (2004).</li><li>Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DNA-binding+domain+of+NR2E3+affect+in+vivo+dimerization+and+interaction+with+CRX.">Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Deriziotis, P., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders:+the+road+ahead.">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder.">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li><li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+genetics+of+speech+and+language.">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations.">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li><li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li><li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability,+autism,+and+language+impairment.">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li><li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries.">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li><li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+DNA+binding+activity+of+the+Foxp1/2/4+family+is+modulated+by+heterotypic+and+homotypic+protein+interactions.">Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions.</a> Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).</li><li>MacDermot, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP2+truncation+as+a+novel+cause+of+developmental+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits.</a> Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).</li><li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

העיצוב של מבני ביטוי חלבון ההיתוך הוא שלב קריטי בהקמת assay ברט. בניסויים שהוצגו כאן, החלבונים של העניין היו התמזגו C-הסופית של בלוציפראז או YFP. זה גם אפשרי, וייתכן שיהיה צורך, הפתיל חלבונים N-הסופית של בלוציפראז / YFP. עבור חלק מחלבונים, התכה עשויה להתקבל רק בבית או N-או C-הסופ...

גם הצמדה קלאסית והדור הבא רצף ניתוחים של הפרעות אדם מגלים את הרלוונטיות הקלינית של חלבונים מעורבים במגוון רחב של מסלולים ביולוגיים. זה קורה לעתים קרובות כי, לפני זיהוי שלהם במחקרים מסוג זה, יש כבר חקירה מועטת או ללא התפקיד הביולוגי של החלבונים האלה. השדרה פורה אחד להתחיל לחקור את התפקוד הביולוגי של חלבון של עניין היא לזהות אילו חלבונים אחרים הוא מקיים אינטראקציה עם בהקשר הפיזיולוגי שלו. אפיון רשתות מולקולריות באופן זה מספק תובנות לגבי המסלולים הביולוגיים העומדים בבסיס הפנוטיפ האנושי. ההקרנה בקנה מידה גדולה ביותר בשימוש לעתים קרובות גישות לזיהוי שותפי אינטראקציה מועמד לחלבונים של עניין הן שמרי הקרנת שתי היברידית 1 ופרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסת 2. שיטות אלו יכולות להיות מוצלחות מאוד שבמרמזות חלבוני אינטראקציה פוטנציאל, אבל arדואר חשוף לתוצאות חיוביות כוזבות. לפיכך, אישור של אינטראקציה זוהתה על ידי שמרי שני היברידיים או הקרנת ספקטרומטריית מסה דורש אימות של האינטראקציה באמצעות טכניקה שנייה. בדרך כלל שיתוף immunoprecipitation או assay הנפתח משמש למטרה זו 3. אחד חסרונות של שימוש בטכניקות כגון לאימות הוא הדרישה לתמוגה תא, שהורסת את התנאים תאיים שעשויה להיות חיוני לשמירה על אינטראקציות חלבון מסוימות. חסרון שני הוא שאינטראקציות חלבון חלשות או חולפות עשויות להיות מופרים במהלך שלבי כביסה. יתר על כן, מבחני אלה דורשים ידיים על זמן משמעותיים, מוגבלים במספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית, ולעתים קרובות דורשים אופטימיזציה זמן רב של חומרים כימיים ופרוטוקולים. כדי להתגבר על חלק מהבעיות הקשורות לשיתוף immunoprecipitation ניסויים, כמה מבחני שפותחו על בסיס ניאון וbiolumחלבוני inescent שניתן להשתמש בתאים חיים. מבחני הראשונים מסוג זה היו מבוססים על הקרינה (או פורסטר) העברת התהודה אנרגיה (סריג), ההעברה לא מקרינה אנרגיה בין שני חלבוני ניאון עם פליטה חופפות וספקטרום עירור 4. היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, ולכן התבוננות בתופעת סריג דורשת כי fluorophores תורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם fluorophore התורם (החלבון פלואורסצנטי נפוץ ציאן; CFP), והשני כהתמזגות עם fluorophore acceptor (החלבון פלואורסצנטי נפוץ צהוב; YFP). אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא fluorophores תורם acceptor מספיק הקרוב ללהתרחש העברת אנרגיה, מה שיגרום לעלייה במדידת הפליטה של ​​אור מביחס acceptor YFP לתורם CFP. FRET היה מוצלח באיתור אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים 4. החסרון העיקרי של שימוש בסריג לאיתור חלבונים אינטראקציות הוא הדרישה לתאורה חיצונית לעירור של fluorophore התורם. תוצאות תאורה חיצוניות ברקע גבוה באות הפליטה, עירור לא רצוי של acceptor, וphotobleaching של שניהם תורמים וfluorophores acceptor. השפעות אלה מפחיתים את הרגישות של assay לאיתור חלבונים אינטראקציות. שינוי של assay סריג שמתגבר על הבעיה של רקע גבוה מתאורה חיצונית הוא העברת פליטת אור התהודה האנרגיה 5,6 assay (ברט). במערכת ברט fluorophore התורם הוא הוחלף על ידי אנזים בלוציפראז. לכן האנרגיה לעירור של fluorophore acceptor נוצרה בתוך המערכת על ידי החמצון של מצע לוציפראז, עיבוד תאורה חיצונית מיותרת. ברובתצורה נפוצה של assay זה, התורם הוא Renilla reniformis לוציפראז וacceptor הוא YFP (לדיון של תורם חלופי וחלבונים acceptor לראות Pfleger et al. 5). בהתאם לכך, במערכת זו, חלבון של עניין הוא קבע את לוציפראז וחלבון באופן פוטנציאלי, באינטראקציה לYFP, או להיפך. Assay ברט דורש תוספת של coelenterazine כמצע ללוציפראז. בגלל coelenterazine הוא תא חדיר, ניתן לבצע מבחני ברט בתאים חיים. עם זאת, coelenterazine ילידים אינם יציב בתמיסה מימית, ואת פירוט האנזים עצמאי של coelenterazine הן מפחית את ריכוז המצע זמין עבור assay ומייצר autoluminescence, אשר מפחיתה את הרגישות של מדידות של פעילות לוציפראז. השימוש בברט בתאים חיים כבר בהנחייתם של פיתוח coelenterazines המוגן, שהם יציבים בתמיסה מימית אבל הם ביקע ידי esterase cytosolicים לאחר דיפוזיה על פני קרום התא כדי לייצר coelenterazine הפעיל בתוך התא 7. בעקבות תוספת של מצע לתאים לבטא לוציפראז וחלבוני YFP-Fusion, העברת אנרגיה וכתוצאה מאינטראקציות בין חלבונים היא לכמת על ידי ניטור פליטה מלוציפראז וYFP. מכיוון שניתן לנטר אינטראקציות חלבון ישירות בתאים חיים בצלחות רב גם, assay ברט מהווה שיטה פשוטה, ניתן להרחבה לאימות אינטראקציות המשוערות שהיא עלות והזמן יעיל. בנוסף לאימות interactors המשוער שזוהה במחקרי הקרנת proteomic, מערכת ברט יכולה לשמש גם לinteractors מועמד מבחן הנובע ממחקרים ביוכימיים ומבניים מוקדמים בחלבון של עניין. ברגע שהקיום של אינטראקציה בין חלבונים כבר נקבע (בין אם באמצעות assay ברט או בטכניקות אחרות), קיימת פוטנציאל לassay ברט להיות EMPloyed נוסף כדי לאפיין את האינטראקציה. לדוגמא, ניתן למפות אזורי האינטראקציה על ידי יצירת גרסאות מקוצצות של החלבונים, ואת מעורבותם של שאריות ספציפיות באינטראקציה ניתן להדגים על ידי יצירת מוטציות נקודתיות. יתר על כן, השפעת הוויסות של שינויי posttranslational או מולקולות קטנות (כגון סמים או ligands) על אינטראקציות בין חלבונים יכולה להיחקר 8-10. Assay ברט יש גם פוטנציאל גדול לחקר מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל. במקרים בהם תפקיד סיבתי מוטציה כבר נקבע, שחקר את ההשפעה של המוטציה על אינטראקציות בין חלבונים באמצעות ברט עשוי לחשוף עוד על אטיולוגיה המולקולרית של פנוטיפ 11. מאז כניסתו של מתודולוגיות הדור הבא של רצף, זה נפוץ יותר ויותר במשך כמה מוטציות שעלולים להיות מזיקות להיות מזוהות בתוך פרט, ובמקרה זה ברור שהם releVant לפנוטיפ 12. במצב זה assay ברט עשוי להיות בעל ערך בהערכת ההשפעה של מוטציות על תפקוד חלבון ומכאן את הרלוונטיות שלהם להפרעה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

מבחני מבוססים על פליטת אור התהודה העברת אנרגיה (ברט) לספק אמצעי רגיש ואמין כדי לפקח על אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. ברט הוא ההעברה לא מקרינה אנרגיה מאנזים לוציפראז &#39;תורם&#39; לחלבון פלואורסצנטי &#39;acceptor&#39;. בתצורה הנפוצה ביותר של assay זה, התורם הוא לוציפראז reniformis Renilla וacceptor הוא חלבון צהוב פלורסנט (YFP). בגלל היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, התבוננות בתופעת ברט דורשת שהתורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין בתאי יונקים בתרבית, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם לוציפראז והשני כהתמזגות עם YFP. אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא תורם acceptor מספיק קרוב ללהתרחש העברת אנרגיה. לעומת טכניקות אחרות לחקירת חלבונים בteractions, assay ברט הוא רגיש, דורש ידיים על קצת זמן וכמה חומרים כימיים, והוא מסוגל לזהות אינטראקציות שהם חלשים, ארעיים, או תלויים בסביבה ביוכימית נמצאת בתוך תא חי. לכן גישה אידיאלית למאשרים אינטראקציות המשוערות שהוצעו על ידי שמרי שני היברידיים או ספקטרומטריית מסת מחקרי פרוטאומיקה, ובנוסף הוא מותאם היטב לאזורי מיפוי אינטראקציה, בוחן את ההשפעה של שינויים שלאחר translational על אינטראקציות בין חלבונים, ו בוחן את ההשפעה של מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל.

העיקרון של assay ברט המתואר באיור 2. התקנת assay בשימוש בכל הניסויים שהוצגו כאן מתוארת באיור 3. זיהוי של אות ברט חזקה מתאי transfected עם חלבון היתוך לוציפראז-YFP אישר כי העברת אנרגיה הייתה ניתן לצפייה בהתקנה ניסיונית זה (איור 4). <p class="jove_content" style=";text-alig...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...