Name: investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00
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플라스미드의 1. 만들기 <ol><li> (그림 1) 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 모두 pLuc 및 pYFP 벡터로 그 각각의 단백질의 cDNA를 서브 클론. 자세한 프로토콜의 경우 녹색 등의 알 (13)에게 참조하십시오. </li><li> 순서는 모든 관심의 단백질이 중간에 정지 코돈을 가진 배낭 / YFP 시퀀스 프레임에 있는지 확인하기 위해 생성합니다. </li><li> 융합 단백질은 생물학적 활성을 유...

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability,+autism,+and+language+impairment.">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li><li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries.">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li><li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

융합 단백질 발현 구조물의 설계는 BRET 분석을 설정하는 중요한 단계이다. 여기에 제시된 실험에서, 관심의 단백질은 루시 페라 제 또는 YFP의 C-말단에 융합되었다. 또한 가능하고, 루시퍼 / YFP의 N-말단에 단백질을 융합하기 위해 필요할 수 있습니다. 일부 단백질의 경우, 융합체는 단백질 구조와 기능의 혼란을 피하기 위하여 N-또는 C-말단 중 하나에서 허용 될 수있다. 또한, 막 횡단 단백질있는 N?...

서열은 인간 질환의 분석 고전 링키지 차세대 모두 생물학적 경로의 범위에 관련된 단백질의 임상 적 관련성을 공개한다. 그것은 이전에 이러한 연구에서의 식별에,이 단백질의 생물학적 역할을 거의 또는 전혀 조사가되어 있는지, 자주 경우입니다. 그 단백질의 생물학적 기능을 탐험 시작하는 한 유익한 수단은 생리 학적 맥락에서 상호 작용하는 다른 어떤 단백질을 식별하는 것입니다. 이 방식으로 분자 네트워크를 특성화하는 것은 인간의 표현형의 기초가되는 생물 학적 경로에 대한 통찰력을 제공합니다. 가장 자주 사용되는 대규모 스크리닝은 또한 단백질 후보 상호 작용 파트너를 식별하기위한 접근법 효모이 - 하이브리드 스크리닝 1 및 질량 분석 기반 단백질 체학이있다. 이러한 방법은 잠재적 인 상호 작용하는 단백질을 제안에 매우 성공적으로 될 수 있지만 아칸소 할 수 있습니다거짓 긍정적 인 결과에 취약 전자. 따라서, 효모이 - 하이브리드 또는 질량 분석법 스크리닝에 의해 식별 상호 작용의 확인은 제 기술을 사용하여 상호 작용의 확인을 요구한다. 일반적으로 공동 면역 또는 풀다운 분석은 이러한 목적으로 3에 사용됩니다. 검증에 대한 그러한 기술을 사용하는 한 가지 단점은 특정 단백질 상호 작용을 유지하기 위해 필수적 일 수있다 세포 내 조건을 파괴하는 세포 용해를위한 필요 조건이다. 두 번째 단점은 약하거나 과도 단백질 상호 작용은 세척 단계에서 중단 될 수 있다는 것이다. 또한, 이들 분석법은 중요한 실제적인 시간을 요구를 동시에 처리 할 수​​있는 샘플의 수에 한정되며, 종종 시약 및 프로토콜의 시간 소모적 인 최적화를 필요로한다. 공동 면역 침전 실험과 관련된 문제들을 극복하기 위해, 몇개의 형광 분석법과 biolum 기반으로 개발되어왔다생균에 사용될 수 inescent 단백질. 최초의 분석은 형광 (또는 포스터) 공명 에너지 전달 (FRET), 중복 방출 및 여기 스펙트럼 4 개의 형광 단백질 사이의 에너지의 비 복사 열전달에 근거했다. 에너지 전달의 효율성 따라서 FRET 현상의 관찰은 기증자와 수용체 형광이 가까이에 있어야 강하게 거리에 의존합니다. 및 수용체의 형광 (일반적으로 노란색 형광 단백질, YFP)과의 융합으로 두 번째, 그 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해, 하나의 단백질은 기증자 형광 (CFP 일반적으로 시안 형광 단백질)를 융합으로 표현된다. 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용은 CFP 기증자에 YFP 수용체의 상대에서 빛의 방출의 측정 증가시킬 것이다, 에너지 전달이 발생하기에 충분히 가까이 기증자와 수용체 형광을 가져올 수 있습니다. FRET는 살아있는 세포 4의 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출에 성공했다. 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하는 FRET 사용의 주된 단점은 도너 형광 물질의 여기를위한 외부 조명을위한 필요 조건이다. 발광 신호 수용체의 원치 않는 여자, 기증자와 수용체의 형광 모두의 광표백 높은 배경의 외부 조명 결과. 이러한 효과는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기위한 분석의 민감도를 감소시킨다. 외부 조명에서 높은 배경의 문제를 극복 FRET 분석의 수정은 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛) 분석 5,6입니다. 브렛 시스템에서 기증자 형광은 루시 페라 제 효소에 의해 대체된다. 따라서 셉터 형광체의 여기를위한 에너지는 불필요한 외부 조명 렌더링 루시퍼 기판의 산화에 의해 시스템 내에서 생성된다. 대부분의이 분석의 일반적인 구성, 기증자는 레 닐라 루시 페라 제를 레니 포르 미스 및 수용체가 (다른 기증자와 수용체 단백질에 대한 설명 피플 등. 5 참조) YFP입니다. 따라서, 이러한 시스템에서는, 그 단백질은 루시퍼 라제 및 잠재적으로 상호 작용하는 단백질 YFP로, 또는 그 반대에 융합된다. 브렛 분석은 루시 페라 제에 대한 기질로 엘렌 테라를 추가해야합니다. 엘렌 테라 세포 투과성이므로, 생균에 BRET 분석법을 수행하는 것이 가능하다. 그러나, 네이티브 엘렌 테라는 수용액 중에 불안정하고, 엘렌 테라의 효소 독립적 고장 분석이 가능하고, 기판의 농도를 감소시키고, 루시퍼 라제 활성의 측정의 감도를 감소 autoluminescence를 생성 둘. 생균의 BRET의 사용은 수용액 중에서 안정하지만, 세포질 에스 테라 제에 의해 절단되어 보호 coelenterazines의 발달에 의해 촉진되었다세포 내에서 활성 7 엘렌 테라를 생성하는 세포의 막에 걸쳐 확산 이후의. 루시퍼 라제 및 YFP 융합 단백질을 발현하는 세포에 대한 기질을 첨가 한 다음, 단백질 - 단백질 상호 작용으로 인해 발생하는 에너지 전달은 루시퍼 라제 및 YFP로부터 방출 모니터링에 의해 정량화된다. 단백질 상호 작용은 멀티 웰 플레이트의 생균 직접 모니터링 할 수 있기 때문에, BRET 분석은 비용 및 시간 효율적인 추정 적 상호 작용을 검증하기위한 단순하고 확장 가능한 방법을 구성한다. 프로테오믹스 스크리닝 연구에서 확인 된 추정 인터랙 유효성 외에 BRET 시스템은 또한 단백질의 생화학 적 및 구조적 종래 연구에서 발생하는 테스트 후보 인터랙하는데 사용될 수있다. 단백질 - 단백질 상호 작용의 존재는 (BRET 분석법을 사용하여 또는 다른 기술에 의해 어느) 설정되면 BRET 분석은 EMP 되려면 전위있어loyed 더욱 상호 작용을 특성화. 예를 들어, 상호 작용 영역은 단백질의 절단 된 버전을 생성하여 매핑 할 수 있고, 상호 작용의 특정 잔기의 참여는 점 돌연변이를 생성함으로써 입증 될 수있다. 또한, 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 전사 후 수정하거나 (예 : 약물이나 리간드 등) 작은 분자의 조절 성 효과는 8-10를 조사 할 수 있습니다. 브렛 분석은 환자의 DNA에서 확인 된 변이를 조사하는 큰 잠재력이있다. 경우에 돌연변이의 원인이되는 역할은 브렛은 표현형 (11)의 분자 원인에 대해 더 보여줄 수 있습니다 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 돌연변이의 효과를 연구, 설립 된 곳. 몇몇 잠재적으로 파괴적인 돌연변이가 RELE가되는 불분명 한 경우에, 개별 내에서 식별 될 차세대 시퀀싱 방법의 출현 때문에, 점점 더 일반적인표현형 12 원하시오. 이 상황에서 브렛 분석은 단백질 기능에 돌연변이의 영향을 평가하는 가치와 장애에 따라서 자신의 관련성을 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)에 기초 분석법은 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 모니터링하는 민감하고 신뢰할 수있는 수단을 제공한다. 브레 트 &#39;수용체&#39;형광 단백질 &#39;기증자&#39;루시퍼 라제 효소의 에너지의 비 복사 전달합니다. 이 분석의 일반적인 구성에서, 도너는 레 닐라 레니 포르 미스 루시페라아제이고 셉터 옐로우 형광 단백질 (YFP)이다. 에너지 전달의 효율이 강하게 거리 종속적이므로, BRET 현상의 관찰은 도너 및 억 셉터가 가까이에있을 것을 요구한다. 배양 된 포유 동물 세포에 대한 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해, 하나의 단백질은 루시퍼와 YFP와 융합으로 두 번째로 융합으로 표현된다. 관심의 두 단백질 사이의 상호 작용은 기증자 및 에너지 전달이 발생하기에 충분히 가까운 수용체를 가져올 수 있습니다. 단백질 - 단백질을 조사하는 다른 기술에 비해teractions는 브렛 분석이 민감하여, 작은 손에 시간과 몇 가지 시약을 필요로하고, 약한 일시적인, 또는 살아있는 세포 내에서 발견 생화학 적 환경에 따라 달라질 수 있습니다 상호 작용을 검출 할 수있다. 따라서, 효모이 - 하이브리드 또는 질량 분석계 프로테오믹스 연구에 의해 제안 된 추정 적 상호 작용을 확인하기위한 최적의 접근 방법이며, 또한 그것은 단백질 - 단백질 상호 작용에 번역 후 변형의 효과를 평가하는, 맵핑 상호 작용 영역에 적합하고, 환자에서 확인 된 DNA 돌연변이의 영향을 평가.

BRET 분석의 원리는도 2에 도시되어있다. 여기에 제시된 실험 전반에 걸쳐 사용 된 분석 셋업은도 3에 도시된다. 루시퍼 라제-YFP 융합 단백질로 형질 감염된 세포에서 강한 BRET 신호의 검출이 에너지 전달이 관찰 것이 확인 이 실험 장치에서 (그림 4). 우리의 연구는 뇌의 발달에있는 전사 억제 자의 FOXP 가족의 역할에 초점을 맞추고 있습니...

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Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

단백질 사이의 상호 작용은 모든 세포 과정에 기본적이다. 생물 발광 공명 에너지 전달을 사용하여, 단백질의 쌍 사이의 상호 작용이 생균에 실시간으로 모니터링 할 수있다. 또한, 병원성 돌연변이의 효과가 평가 될 수있다.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

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In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

형광 공명 에너지 전송과 리간드 - 수용체 상호 작용의 실시간 모니터링

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...