Name: investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Эта работа была поддержана Общества Макса Планка.

1. Создание плазмид <ol><li> Субклонировани кДНК для каждого интересующего белка в обоих векторов pLuc и pYFP, ​​с использованием стандартных способов молекулярной биологии (рис. 1). Подробные протоколы см. Зеленый и др. 13. </li><li> Последовательность всех строит, чтобы убедит?...

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li><li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening.">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li><li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+ubiquitination+in+living+cells+by+BRET.">Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET.</a> Nat Methods. 1, 203-208 (2004).</li><li>Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DNA-binding+domain+of+NR2E3+affect+in+vivo+dimerization+and+interaction+with+CRX.">Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Deriziotis, P., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders:+the+road+ahead.">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder.">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li><li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+genetics+of+speech+and+language.">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations.">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li><li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li><li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability,+autism,+and+language+impairment.">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li><li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries.">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li><li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+DNA+binding+activity+of+the+Foxp1/2/4+family+is+modulated+by+heterotypic+and+homotypic+protein+interactions.">Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions.</a> Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).</li><li>MacDermot, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP2+truncation+as+a+novel+cause+of+developmental+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits.</a> Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).</li><li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

Конструкция экспрессирующих конструкций гибридного белка является важным шагом в создании Брет анализа. В экспериментах, представленных здесь, белки, представляющие интерес, слит с С-концом люциферазы или YFP. Кроме того, возможно, и может быть необходимым, чтобы сплавить протеины к N-ко...

Оба классическая связь и следующего поколения секвенирования анализ нарушений в организме человека являются выявление клиническую значимость белков, участвующих в диапазоне биологических путей. Это часто бывает, что до их идентификации в таких исследований, было мало или вообще не исследование биологической роли этих белков. Один плодотворным начать изучение биологической функции белка интереса является определить, какие другие белки он взаимодействует с в физиологическом контексте. Характеризуя молекулярные сети таким образом дает представление о биологических путей, лежащих в основе фенотипа человека. Наиболее часто используемый масштабный скрининг подходов для идентификации партнеров кандидатов взаимодействия белков, представляющих интерес, дрожжи двугибридная скрининг 1 и масс-спектрометрии на основе протеомики 2. Эти методы могут быть очень успешным в предложении потенциальных взаимодействующих белков, но аре уязвимы к ложным положительным результатам. Таким образом, подтверждение взаимодействия, определенных дрожжей двух гибридных или массового скрининга спектрометрии требуется проверку взаимодействия с использованием второго технику. Обычно со-иммунопреципитацию или тянуть вниз анализ используют для этой цели 3. Одним из недостатков использования таких методов для проверки является требование к лизису клеток, которая разрушает внутриклеточные условия, которые могут быть необходимы для поддержания определенных белковых взаимодействий. Вторым недостатком является то, что слабые или переходные белковых взаимодействий может быть нарушена во время стадий промывки. Кроме того, эти анализы требуют значительных практического времени, ограничены в количестве образцов, которые могут быть обработаны одновременно, и часто требуют много времени оптимизации реагентов и протоколов. Чтобы преодолеть некоторые из проблем, связанных с со-иммунопреципитации экспериментов, несколько анализы были разработаны на основе флуоресцентных и bioluminescent белки, которые могут быть использованы в живых клетках. Первые такие анализы были основаны на флуоресценции (или Ферстер) резонансный перенос энергии (FRET), не-лучистого переноса энергии между двумя флуоресцентных белков с перекрытием спектров испускания и возбуждения 4. Эффективность передачи энергии сильно зависящая от расстояния, поэтому наблюдение явления FRET требует, чтобы доноров и акцепторов флуорофоры находиться в непосредственной близости. Для проверки взаимодействия между двумя белками, представляющих интерес, один белок экспрессируется в виде слияния с донорного флюорофора (обычно голубой флуоресцентный белок; CFP) и второй виде слитого с акцепторного флюорофора (обычно желтого флуоресцентного белка; YFP). Взаимодействие между двумя белками интересов может привести донора и акцептора флуорофоры достаточно близкие для передачи энергии происходят, что приведет к ощутимым увеличением эмиссии света от YFP акцепторной относительно донора CFP. FRET успешно обнаружения белок-белковых взаимодействий в живых клетках 4. Основным недостатком использованием FRET для обнаружения белок-белковых взаимодействий является требование наружного освещения для возбуждения доноров флуорофора. Внешние результаты освещенности в высоком фоне в сигнале выбросов, нежелательного возбуждения акцептора и фотообесцвечивания как донора и акцептора флуорофорами. Эти эффекты уменьшить чувствительность анализа для обнаружения белок-белковых взаимодействий. Модификация FRET анализа, который преодолевает проблему высокой фоне из наружного освещения является передача Биолюминесценция резонансной энергии (BRET) анализ 5,6. В системе BRET донор флуорофор заменен фермента люциферазы. Таким образом, энергия возбуждения акцепторного флюорофора генерируется внутри системы окислением люциферазы субстрата, что делает ненужным внешний освещение. В наиболеестандартная конфигурация этого анализа, донором является Renilla reniformis люциферазу и акцептора YFP (для обсуждения альтернативного донора и акцепторных белков см. Pfleger соавт. 5). Соответственно, в этой системе, представляющий интерес белок слит с люциферазы и потенциально-взаимодействующего белка к YFP, или наоборот. BRET анализ требует добавления коэлентеразина в качестве субстрата для люциферазы. Поскольку целентеразин является проницаемым для клеток, можно выполнить BRET анализов в живых клетках. Тем не менее, родной целентеразин неустойчиво в водном растворе, и фермент-независимый пробой коэлентеразина и снижает концентрацию субстрата, доступной для анализа и генерирует autoluminescence, что снижает чувствительность измерений активности люциферазы. Использование BRET в живых клетках было облегчено развитию охраняемых coelenterazines, устойчивых в водном растворе, но расщепляются цитозольным эстеразыс после диффузии через клеточную мембрану, чтобы генерировать активный коэлентеразина внутри клетки 7. После добавления субстрата в клетках, экспрессирующих люциферазы-и YFP-слитые белки, передача энергии в результате белок-белковых взаимодействий количественно путем мониторинга выбросов от люциферазы и YFP. Поскольку белковые взаимодействия можно контролировать непосредственно в живых клетках в мульти-луночных планшетах, анализ BRET представляет собой простую, масштабируемую способ проверки предполагаемых взаимодействий, что является экономически и эффективный по времени. В дополнение к проверке предполагаемых interactors выявленных в протеомных скрининговых исследований, система BRET также может быть использован для тестирования кандидатов interactors, вытекающих из предыдущих биохимических и структурных исследований по представляющим интерес белком. После того, как существование белок-белкового взаимодействия было установлено (либо с помощью анализа BRET или другими методами), существует возможность BRET анализ быть EMPloyed далее характеризуют взаимодействие. Например, взаимодействующие участки могут быть отображены путем генерации усеченные варианты белков, и вовлечение специфических остатков в взаимодействия может быть продемонстрирована путем создания точечных мутаций. Кроме того, модулирующее действие посттрансляционных модификаций или малых молекул (например, лекарственных препаратов или лигандов) на белок-белковых взаимодействий могут быть исследованы 8-10. BRET анализ также имеет большой потенциал для исследования мутаций, выявленных в ДНК пациента. В случаях, когда была создана причинную роль для мутации, изучении влияния мутации на белок-белковых взаимодействий с помощью BRET может выявить больше о молекулярном этиологии фенотипа 11. С появлением методик секвенирования следующего поколения, становится все более распространенным в течение нескольких потенциально повреждающих мутации, которые будут определены в течение индивидуума, и в этом случае остается неясным, которые РелеВант в фенотипе 12. В этой ситуации анализ BRET может быть ценным в оценке воздействия мутаций на функцию белка и, следовательно, их актуальность для расстройства.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

Анализы, основанные на Биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) обеспечивают чувствительные и надежные средства контроля за белок-белковых взаимодействий в живых клетках. BRET является безызлучательное передача энергии от «донора» фермента люциферазы к «акцепторной» флуоресцентного белка. В наиболее общем конфигурации этом анализе донор Renilla reniformis люциферазы и акцептора желтый флуоресцентный белок (YFP). Поскольку эффективность передачи энергии сильно зависящая от расстояния, наблюдение явления BRET требует, чтобы донор и акцептор находиться в непосредственной близости. Для проверки взаимодействия между двумя представляющих интерес белков в культивируемых клетках млекопитающих, один белок экспрессируется в виде слияния с люциферазы, а второй в виде слияния с YFP. Взаимодействие между двумя представляющих интерес белков может привести донора и акцептора достаточно близко для передачи энергии происходит. По сравнению с другими методами для исследования белок-белковых ввзаимодействий, анализ BRET чувствителен, требует мало практического времени и несколько реагентов, и способен обнаруживать взаимодействия, которые слабы, преходящее, или зависит от биохимической среде найденного в живой клетке. Поэтому идеальный подход для подтверждения предполагаемых взаимодействий предложенные дрожжей двух гибридных или масс-спектрометрии протеомики исследований, и, кроме того это хорошо подходит для отображения взаимодействия регионов, оценивает эффект от пост-трансляционных модификаций на белок-белковых взаимодействий, и оценки воздействия мутаций, выявленных в ДНК пациента.

Принцип BRET анализа показан на рисунке 2. Установка анализ используется во всех экспериментах, представленных здесь изображен на рисунке 3. Обнаружение сильного сигнала от BRET клеток, трансфицированных слитого белка люциферазы-YFP подтвердил, что передача энергии можно ...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Взаимодействия между белками являются основополагающими для всех клеточных процессов. Использование биолюминесценции резонансный перенос энергии, взаимодействие между парой белков можно контролировать в живых клетках и в реальном времени. Кроме того, эффекты потенциально патогенных мутаций могут быть оценены.

Исследование белок-белковых взаимодействий в живых клетках с помощью биолюминесценции резонансный перенос энергии

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Микрожидкостных сотрудничества культуре эпителиальных клеток и бактерий по расследованию Растворимый Сигнал-опосредованного взаимодействия

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Исследование тканей и органов конкретных Фитохром ответы с помощью FACS-помощь камерного типа Конкретные профилирования выражения в Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Изображениями белок-белковых взаимодействий В естественных условиях</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Мониторинг в реальном времени лиганд-рецепторных взаимодействий с флуоресцентной резонансного переноса энергии

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Исследование высокой плотности белковых Функциональные Microarrays для обнаружения белок-белковых взаимодействий

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

В режиме реального времени измерения мембранного белка: рецептор взаимодействий с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Выявление белок-белковых сайтов взаимодействие по пептидов массивов

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...