Name: investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Max Planck-sällskapet.

1. Skapande av plasmider <ol><li> Subklona cDNA för varje protein av intresse i både de pLuc och pYFP vektorerna, med hjälp av standardmässiga molekylärbiologiska tekniker (Figur 1). För detaljerade protokoll se Green m.fl. 13. </li><li> Sekvens alla konstruktioner för att kontrollera att de proteiner av intresse är i ram med Luc / YFP sekvens utan några mellanliggande stoppkodoner. </li><li> Utför funktionella analyser som önskas för att bekräfta att fusionsproteinern...

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li><li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening.">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li><li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+ubiquitination+in+living+cells+by+BRET.">Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET.</a> Nat Methods. 1, 203-208 (2004).</li><li>Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DNA-binding+domain+of+NR2E3+affect+in+vivo+dimerization+and+interaction+with+CRX.">Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Deriziotis, P., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders:+the+road+ahead.">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder.">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li><li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+genetics+of+speech+and+language.">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations.">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li><li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li><li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability,+autism,+and+language+impairment.">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li><li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries.">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li><li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+DNA+binding+activity+of+the+Foxp1/2/4+family+is+modulated+by+heterotypic+and+homotypic+protein+interactions.">Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions.</a> Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).</li><li>MacDermot, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP2+truncation+as+a+novel+cause+of+developmental+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits.</a> Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).</li><li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

Utformningen av fusionsproteinexpressionskonstruktionerna är ett kritiskt steg i upprättandet av BRET analysen. I de experiment som presenteras här var de proteiner av intresse smält till C-änden av luciferas eller YFP. Det är även möjligt, och kan vara nödvändigt, för att sammansmälta proteiner till N-terminus av luciferas / YFP. För vissa proteiner kan fusioner accepteras endast på antingen N-eller C-terminalen för att undvika avbrott i proteiners struktur och funktion. Dessutom, för transmembranprotei...

Både klassisk koppling och nästa generations sekvensering analyser av mänskliga sjukdomar avslöjar den kliniska relevansen av proteiner involverade i en rad biologiska banor. Det är ofta så att, före deras identifiering i sådana studier, har det varit lite eller ingen undersökning av den biologiska rollen av dessa proteiner. En fruktbar väg att börja utforska den biologiska funktionen hos ett protein av intresse är att identifiera vilka andra proteiner det interagerar med i dess fysiologiska sammanhang. Karakterisera molekylära nätverk på detta sätt ger insikter i de biologiska mekanismer som ligger bakom människans fenotyp. Den mest använda storskalig screening metoder för att identifiera kandidatinteraktionspartner för proteiner av intresse är jäst två-hybrid screening 1 och masspektrometri-baserad proteomik 2. Dessa metoder kan vara mycket framgångsrik i att föreslå potentiella interagerande proteiner, men are utsatta för falska positiva resultat. Därför är en bekräftelse på en interaktion identifieras av jäst två-hybrid eller masspektrometri screening kräver validering av interaktionen med hjälp av en annan metod. Typiskt en co-immunoprecipitation eller pull-down-analysen används för detta ändamål 3. En nackdel med att använda sådana tekniker för validering är kravet för cellys, vilket förstör de intracellulära förhållanden som kan vara nödvändigt för att hålla vissa proteininteraktioner. En andra nackdel är att svaga eller transienta proteininteraktioner kan störas under tvättningsstegen. Dessutom är dessa analyser kräver betydande praktisk tid, är begränsade i antalet prover som kan behandlas samtidigt, och kräver ofta tidskrävande optimering av reagenser och protokoll. För att övervinna några av de problem som är förknippade med co-immunoprecipitation experiment har flera tester utvecklats baserat på fluorescerande och bioluminescent proteiner som kan användas i levande celler. De första analyserna var baserade på fluorescens (eller Förster) resonansenergiöverföring (FRET), den icke-strålande energiöverföring mellan två fluorescerande proteiner med överlappande emissions-och exciteringsspektra 4. Effektiviteten för energiöverföring är starkt avståndsberoende därför observation av FRET-fenomen kräver att donator-och acceptor-fluoroforer vara i omedelbar närhet. För att testa med avseende på en interaktion mellan två proteiner av intresse, är ett protein som uttrycks som en fusion med donatorfluoroforen (vanligen cyan fluorescent protein, GFP) och den andra som en fusion med acceptorfluoroforen (vanligen gul fluorescerande protein; YFP). En interaktion mellan de två proteiner av intresse kan föra donator och acceptor fluoroforer tillräckligt nära för energiöverföring att ske, vilket kommer att leda till en mätbar ökning av utsläpp av ljuset från YFP acceptor i förhållande till den gemensamma fiskeripolitiken donatorn. FRET har varit framgångsrik i att upptäcka protein-proteininteraktioner i levande celler 4. Den huvudsakliga nackdelen med användning av FRET för att detektera protein-proteininteraktioner är kravet på extern belysning för excitering av donatorfluoroforen. Ytterbelysning ger hög bakgrund i emissionssignalen, oönskad excitation av acceptor, och fotoblekning för både givare och acceptor fluoroforer. Dessa effekter minskar känsligheten hos analysen för att detektera protein-proteininteraktioner. En modifiering av FRET-assay, som övervinner problemet med höga bakgrunden från ytterbelysning är Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-analys 5,6. I BRET systemet donatorfluoroforen är ersatt med en luciferas-enzymet. Sålunda energin för exciteringen av acceptorfluoroforen alstras inom systemet genom oxidation av ett luciferas-substrat, vilket gör ytterbelysning onödig. I den mestvanlig konfiguration av denna analys, som är givare Renilla reniformis-luciferas och acceptorn är YFP (för en diskussion av alternativa donator-och acceptor-proteiner se Pfleger et al. 5). Följaktligen, i detta system är ett protein av intresse smält till luciferas och ett potentiellt interagerande protein till YFP, eller vice versa. Den BRET-analysen kräver tillsats av coelenterazine som substrat för luciferas. Eftersom coelenterazin är cell-permeabel, är det möjligt att utföra BRET analyser i levande celler. Emellertid är nativt coelenterazine instabil i vattenlösning, och enzymet oberoende uppdelning av coelenterazin både reducerar koncentrationen av substratet tillgängligt för analysen och genererar autoluminescence, vilket minskar känsligheten hos mätningar av luciferasaktivitet. Användningen av BRET i levande celler har underlättats genom utvecklingen av skyddade coelenterazines, vilka är stabila i vattenlösning men klyvs av cytosolisk esterass efter diffusion över cellmembranet för att generera aktiv coelenterazine inuti cellen 7. Efter tillsats av substrat till celler som uttrycker luciferas-och YFP-fusionsproteiner, är energiöverföringen till följd av protein-proteininteraktioner kvantifierades genom övervakning av utsläpp från luciferas och YFP. Eftersom proteininteraktioner kan övervakas direkt i levande celler i flerbrunnsplattor, utgör BRET-analysen en enkel, skalbar metod för validering förmodade interaktioner som är kostnads-och tidseffektivt. Förutom att validera förmodade interactmedlemmar identifierats i proteomic screeningstudier kan BRET systemet också användas för att testa kandidatinteragerande som härrör från tidigare kända biokemiska och strukturella studier av proteinet av intresse. Så snart det finns en protein-proteininteraktion har fastställts (antingen genom att använda BRET analysen eller genom andra tekniker), det finns potential för BRET analysen för att vara anstlegerade ytterligare karaktärisera interaktionen. Till exempel kan de samverkande regionerna kartläggas genom att generera stympade versioner av proteinerna, och medverkan av specifika rester i interaktionen kan visas genom att skapa punktmutationer. Vidare kan den modulerande effekten av posttranslationella modifieringar eller små molekyler (såsom läkemedel eller ligander) på protein-proteininteraktioner undersökas 8-10. Den BRET-analysen har också stora möjligheter att utreda mutationer som identifierats i patientens DNA. I fall där en orsakande roll för en mutation har fastställts, att studera effekten av mutationen på protein-protein-interaktioner med användning BRET kan avslöja mer om den molekylära etiologin av fenotypen 11. Sedan tillkomsten av nästa generations sekvenseringsmetoder, är det allt vanligare att flera potentiellt skadliga mutationer kan identifieras inom en individ, i vilket fall det är oklart vilka är relevantavanta till fenotypen 12. I denna situation BRET analysen kan vara värdefullt för att utvärdera effekten av mutationer på proteiners funktion och därmed deras relevans för sjukdom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

Analyser baserade på Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) ger en känslig och tillförlitligt sätt att övervaka protein-proteininteraktioner i levande celler. BRET är den icke-strålningstransport av energi från en &quot;givare&quot; luciferas enzym till en &quot;acceptor&quot; fluorescerande protein. I den vanligaste konfigurationen för denna analys, är givare Renilla reniformis-luciferas och acceptorn är gul fluorescerande protein (YFP). Eftersom effektiviteten i energiöverföring är starkt avståndsberoende, kräver observation av BRET fenomenet att givaren och mottagaren vara i närheten. För att testa en interaktion mellan två proteiner av intresse i odlade däggdjursceller, är ett protein uttrycks som en fusion med luciferas och den andra som en fusion med YFP. En interaktion mellan de två proteiner av intresse kan föra givaren och acceptorn är tillräckligt nära för att energiöverföring skall ske. Jämfört med andra tekniker för att undersöka protein-protein iteractions, den BRET-analysen är känslig, kräver lite praktisk tid och några reagenser, och kan upptäcka interaktioner som är svag, övergående, eller beroende av den biokemiska miljön finns inom en levande cell. Det är därför en idealisk metod för att bekräfta förmodade interaktioner föreslagits av jäst två-hybrid eller masspektrometri proteomik studier, och dessutom är väl lämpad för kartläggning samverkande regionerna, att bedöma effekten av posttranslationella modifieringar på protein-proteininteraktioner, och utvärdera effekten av mutationer som identifierats i patientens DNA.

Principen för BRET analysen illustreras i figur 2. Analysen inställnings använts genom experiment som presenteras här är avbildad i figur 3. Detekteringen av en stark BRET signalen från celler som transfekterats med en luciferas-YFP fusionsproteinet bekräftades att energiöverföring kunde observeras i denna experimentuppställning (Figur 4). Vår forskning fokuserar på den roll som FOXP familj av transkriptions repressors i hjärnan...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Interaktioner mellan proteiner är grundläggande för alla cellulära processer. Använda Bioluminescence Resonance Energy Transfer, kan interaktionen mellan ett par av proteiner följas i levande celler och i realtid. Vidare kan effekterna av potentiellt patogena mutationer bedömas.

Undersökning av protein-proteininteraktioner i levande celler med hjälp Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

Mikroflödessystem Co-kultur av epitelceller och bakterier för att utreda Löslig Signal-medierade interaktioner

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Undersöka Tissue-och orgel-specifika Phytochrome Svar med FACS-assisterad Cell-typspecifika expression profiling i Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In vivo Detektion av protein-protein interaktioner på mikro-mönstrade ytor

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein interaktioner In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Realtidsövervakning av ligand-receptor interaktion med fluorescensresonansenergiöverföring

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaktioner visualiseras genom Bimolecular Fluorescens Komplettering i tobaksprotoplaster och Löv

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Sondering hög densitet funktionellt protein Microarrays att upptäcka protein-proteininteraktioner

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifiera protein-proteininteraktion webbplatser Använda peptid Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...