Name: combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-dna interactions
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00
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Nous remercions Gijs Wuite, Erwin JG Peterman, et Peter Gross pour l&#39;aide à la microfluidique et Alessia Tempestini de l&#39;aide pour la préparation des échantillons. Cette recherche a été financée par le septième programme-cadre de l&#39;Union européenne (7e PC / 2007-2013) sous convention de subvention n ° 284464 et par le ministère italien de l&#39;éducation, Université et recherche FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro dans Ricerca 2013 RBFR13V4M2, et dans le cadre de la NANOMAX projet phare.

1. optiques pincettes installation avec nanomètre stabilité Le dispositif expérimental doit fournir deux pinces optiques à pointer la stabilité au niveau et l&#39;intensité nanomètre fluctuations du laser de piégeage en dessous de 1%. La combinaison de ces conditions sera d&#39;assurer la stabilité du nanomètre de l&#39;haltère sous tension typique (1 pN - quelques dizaines de PN), la rigidité de piège (0,1 pN / nm) et la bande passante de mesure (taux d&#39;acquisition d&#39;imag...

<ol>
	<li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level.">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li><li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+mechanisms,+one+molecule+at+a+time.">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes &amp; development. 25, 1205-1231 (2011).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level.">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads.">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li><li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers.">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li><li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase.">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes.">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li><li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers.">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li><li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+optical+trapping,+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li><li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time.">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li><li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension.">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiona+in+the+trap:+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).</li><li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy:+enhanced+photobleaching+of+fluorophores.">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li><li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle.">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li><li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+laser+trap/flow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules.">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li><li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions.">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li><li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping.">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor,+single-molecule+fluorescence+imaging.">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li><li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA+with+optical+tweezers.">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li><li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization.">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li><li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers.">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li></ol>

Dans la dernière décennie, les techniques de manipulation et d&#39;imagerie de molécules simples ont vu de grands progrès en termes de résolution spatiale et temporelle. La combinaison des techniques de manipulation et d&#39;imagerie est à la base de puissants outils qui permettent maintenant le contrôle de l&#39;état mécanique d&#39;un polymère biologique unique, tels que ADN, ARN ou du cytosquelette des filaments, et la localisation simultanée de protéines individuelles en interaction avec le même polymè...

Molécule unique (SM) techniques ont considérablement développé au cours des trente dernières années pour répondre à la nécessité de surmonter certaines des limites de mesures de la solution, en vrac traditionnels 1-3. La manipulation de molécules biologiques simples a créé la possibilité de mesurer les propriétés mécaniques des biopolymères 4 et de contrôler les paramètres mécaniques de protéine-protéine 5 et interactions protéine-ADN 6,7. SM détection de fluorescence, d&#39;autre part, représente un outil très polyvalent pour l&#39;étude de l&#39;activité de la protéine in vitro et in vivo, ce qui conduit à la possibilité de localisation et de suivi de molécules individuelles avec une précision nanométrique. Par ajustement de l&#39;appareil d&#39;étalement de point de fonction-SM de l&#39;image, en fait, on peut réaliser avec une précision de localisation en fonction principalement de rapport signal-sur-bruit (SNR) et d&#39;atteindre une limite de l&#39;ordre de 8,9 nanomètre. Ces méthodologies trouver puissantedes applications dans l&#39;étude de la dynamique des protéines motrices, ainsi que des processus de diffusion qui sous-tendent la recherche de cible dans des protéines de liaison à l&#39;ADN. La fonction de détermination de constantes de diffusion en fonction de la séquence d&#39;ADN, le temps de séjour sur la cible et en mesurant la longueur de l&#39;ADN étudié lors d&#39;événements de diffusion à une dimension avec précision, représentent un outil puissant pour l&#39;étude de la dynamique de l&#39;interaction protéine-ADN et à l&#39;enquête des mécanismes de recherche de cible spécifique. Récemment, la combinaison de ces deux techniques a produit une nouvelle génération de dispositifs expérimentaux de 10 à 14 permettant la manipulation simultanée d&#39;un substrat biologique (par exemple un filament d&#39;actine ou une molécule d&#39;ADN) et la détection / localisation d&#39;un partenaire d&#39;interaction enzyme (par exemple myosine ou d&#39;une protéine de liaison à l&#39;ADN). Les avantages de ces techniques reposent principalement sur la possibilité d&#39;exercer un contrôle mécanique sur le polymère piégé, ainsi enabling l&#39;étude de la dynamique d&#39;interaction par rapport à des forces ou des couples. En outre, la méthode permet de mesurer les réactions biochimiques loin de la surface, en évitant l&#39;une des principales limites des méthodes classiques SM, à savoir, la nécessité pour l&#39;immobilisation des molécules à l&#39;étude sur une surface (lame de verre ou microsphères). La combinaison des deux techniques de molécules simples, il faut surmonter plusieurs difficultés techniques, principalement en raison des exigences de stabilité mécanique et SNR suffisant (en particulier en exigeant la localisation avec une précision nm) 15. En particulier, lors de l&#39;accouplement détection par fluorescence SM avec des pincettes optiques, la réduction du bruit et photoblanchiment des lasers infrarouges piégeage 16 et le contrôle des tampons biochimiques pour l&#39;assemblage des complexes biologiques et la performance des mesures expérimentales 11 sont d&#39;une importance primordiale. Ici, nous décrivons les méthodes pour effectuer avec succèsmesures dans une configuration de localisation double piégeage / SM fluorescence. La méthodologie est illustrée par l&#39;exemple de la protéine répresseur lactose (Lad) marqué par fluorescence (avec Atto532) et détecté comme il se lie à une molécule d&#39;ADN (coincé entre deux pinces optiques) contenant des séquences spécifiques Laci liaison (c.-à-opérateurs). Nous démontrons l&#39;efficacité de la méthode de détection de la liaison à l&#39;ADN de LacI et la diffusion le long de son contour dans le processus de recherche de cible. La méthode est applicable à n&#39;importe quelle combinaison de séquences d&#39;ADN et de protéine de liaison à l&#39;ADN, ainsi que pour d&#39;autres systèmes (microtubules ou des filaments d&#39;actine et de protéines interagissant avec les moteurs).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:141px;">Company</td>
			<td style="width:167px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:151px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:203px;">Web Address</td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:115px;">elastomeric isolators</td>
			<td style="width:141px;">Newport</td>
			<td style="width:167px;">Newdamp</td>
			<td style="width:151px;">Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies</td>
			<td><a href="http://www.newport.com/">http://www.newport.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">optical isolator</td>
			<td style="width:141px;">Optics for Research</td>
			<td style="width:167px;">IO-3-YAG-VHP</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ofr.com/">http://www.ofr.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength</td>
			<td style="width:141px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:167px;">Millennia IR</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.newport.com/">http://www.newport.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">acousto-optic deflectors (AODs)</td>
			<td style="width:141px;">A&#38;A optoelectronic</td>
			<td style="width:167px;">DTS-XY 250</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.aaoptoelectronic.com/">http://www.aaoptoelectronic.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Direct Digital Synthesizers</td>
			<td style="width:141px;">Analog Devices</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.analog.com/">http://www.analog.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">quadrant detector photodiodes</td>
			<td style="width:141px;">OSI optoelectronics</td>
			<td style="width:167px;">SPOT-15-YAG</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.osioptoelectronics.com/">http://www.osioptoelectronics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">DIO and FPGA board</td>
			<td style="width:141px;">National Instruments</td>
			<td style="width:167px;">NI-PCI-7830R</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ni.com/">http://www.ni.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Halogen lamp</td>
			<td style="width:141px;">Schott</td>
			<td style="width:167px;">KL 1500 LCD</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.schott.com/">http://www.schott.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Condenser</td>
			<td style="width:141px;">Olympus</td>
			<td style="width:167px;">U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.olympus-global.com/en/">http://www.olympus-global.com/en/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">Objective</td>
			<td style="width:141px;">Nikon</td>
			<td style="width:167px;">CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">532 nm laser</td>
			<td style="width:141px;">Coherent</td>
			<td style="width:167px;">Sapphire</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.coherent.com/">http://www.coherent.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">CCD 200X and 2000X</td>
			<td style="width:141px;">Hamamatsu&#160;</td>
			<td style="width:167px;">XC-ST70 CE</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamamatsu.com/">http://www.hamamatsu.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electron-multiplied CCD</td>
			<td style="width:141px;">Hamamatsu&#160;</td>
			<td style="width:167px;">C9100-13</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.hamamatsu.com/">http://www.hamamatsu.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">piezo stage with nm-accuracy</td>
			<td style="width:141px;">Physik Instrumente</td>
			<td style="width:167px;">P-527.2CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.physikinstrumente.com/">http://www.physikinstrumente.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Emission Filter</td>
			<td style="width:141px;">Chroma Technologies</td>
			<td style="width:167px;">600/100m</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.chroma.com/">http://www.chroma.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">silica beads (1.54 mm)</td>
			<td style="width:141px;">Bangs Laboratories</td>
			<td style="width:167px;">SS04N/5303</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bangslabs.com/">http://www.bangslabs.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:141px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">B4287</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">pentyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">46022</td>
			<td style="width:151px;">Flammable liquid and vapour (No 1272/2008)</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">nitrocellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8267-5EA</td>
			<td style="width:151px;">Flammable solid&#160; (No 1272/2008)</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">heat block</td>
			<td style="width:141px;">MPM Instruments Srl</td>
			<td style="width:167px;">M502-HBD</td>
			<td style="width:151px;">with 2 removable blocks; preheated at 120&#176; C</td>
			<td><a href="http://www.mpminstruments.com/">http://www.mpminstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NanoPort assemblies</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific Inc.</td>
			<td style="width:167px;">N-333</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">polyetheretherketone tubing&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific Inc.</td>
			<td style="width:167px;">1535</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luer lock-tip syringes 2.5 mL</td>
			<td style="width:141px;">Terumo</td>
			<td style="width:167px;">SS 02LZ1</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.terumomedical.com/">http://www.terumomedical.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">shut-off valves&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">P-732</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">flangeless fittings&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">LT-111</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">fluorinated ethylene propylene tubing&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Upchurch Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">1549</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.upchurch.com/">http://www.upchurch.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:203px;">two computer-controlled solenoid valves</td>
			<td style="width:141px;">Clippard, Cincinnati, USA</td>
			<td style="width:167px;">ET-2-H-M5</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.clippard.com/">http://www.clippard.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pressure transducer</td>
			<td style="width:141px;">Druck LTD</td>
			<td style="width:167px;">PTX 1400</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">biotin-14-dCTP&#160;</td>
			<td style="width:141px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:167px;">19518-018</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">http://www.lifetechnologies.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)</td>
			<td style="width:141px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:167px;">EP0161</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.thermoscientificbio.com/">http://www.thermoscientificbio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO532 maleimide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">68499</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="157">
			<td height="157" style="height:157px;width:203px;">N,N-dimethylformamide (DMF)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">227056</td>
			<td style="width:151px;">Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">C4706</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:203px;">L-Glutathione reduced (GSH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">G4251</td>
			<td style="width:151px;">Acute toxicity, Oral (Category 5), H303</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:203px;">Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10&#160;kDa cutoff spin concentrators</td>
			<td style="width:141px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:167px;">UFC901024</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.merckmillipore.it/">http://www.merckmillipore.it/</a></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 &#181;m</td>
			<td style="width:141px;">Spherotech, Inc.</td>
			<td style="width:167px;">SVP-15-5</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.spherotech.com/">http://www.spherotech.com/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-dna interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Dans une expérience réussie, une (ou plusieurs) des protéines marquées subissent liaison / déliaison diffusion et / ou monodimensionnelle long de la molécule d&#39;ADN (figure 3A). La localisation des protéines le long de la molécule d&#39;ADN permet la quantification de paramètres cinétiques en fonction de la séquence d&#39;ADN. Lorsque les conditions de tampon provoquant la diffusion 1D sont appliqués, il est possible de suivre des trajectoires de protéines, et de déterminer, par exemple...

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Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

La combinaison unique molécule manipulation et d&#39;imagerie pour l&#39;étude des interactions protéine-ADN

Nous décrivons ici l&#39;instrumentation et des méthodes pour la détection de molécules de protéine unique marqués par fluorescence qui interagissent avec une molécule d&#39;ADN unique suspendu entre deux microsphères optiquement piégés.

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

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