Name: polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة منحة (CIHR MOP-115195) وFRQ-S لتكنولوجيا المعلومات، وهو أيضا المستفيد من CIHR جائزة الباحث الشاب؛ ومجلس الأبحاث السويدي وجمعية السرطان السويدية لOL

<ol>
	<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes:+a+systems+biology+view.">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li><li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells.">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases.">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li><li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways.">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation.">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li><li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease.">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer:+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways.">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li><li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease.">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li><li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+neurodegeneration:+role+and+impact.">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li><li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease.">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments.">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li><li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells.">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li><li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1.">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li><li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide.">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li><li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome.">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li><li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+translational+control+in+CD4++T+cell+subsets.">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13 (2013).</li><li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis.">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li><li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins.">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li><li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

يصف هذا المقال بروتوكول polysome تجزئة راسخة تليها طريقة التحليل في المنزل وضعت لالتقاط التغيرات النوعية والكمية في النشاط متعدية على نطاق الجينوم واسعة في خلايا الثدييات. لوينبغي إيلاء الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول اهتمام خاص ل1) الخلية confluency (حيث أن أسعار انتشار وتوافر المواد الغذائية ترتبط مع نشاط الترجمة مرنا ويمكن أن تؤثر على تكوين translatome، ينبغي أن تكون الخلية confluency متناسقة عبر مكررات والظروف التجريبية)، 2) تحلل الخلايا السريع (على الرغم من وجود سيكلوهيكسيميد ومثبطات ريبونوكلياز في مخازن، وينبغي أن يكون تحلل سريع، وينبغي مضافين مقتطفات الخلوية على التدرجات السكروز مباشرة بعد تحلل الحمض النووي الريبي لمنع تدهور وتفكك polysomes)، 3) إعداد التدرج (لضمان عالية استنساخ البيانات، ينبغي إعداد التدرجات السكروز باستخدام صانع التدرج وجمعية مهندسي البترولينبغي توخي الحذر عند التعامل معها االجتماعية). بالإضافة إلى دراسة التغيرات في النشاط متعدية، هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل المجمعات البروتين المرتبط الريبوسوم وإقامة وظائفها الفسيولوجية. تحقيقا لهذه الغاية، يمكن تحديد مستويات وحالة الفسفرة من مختلف البروتينات المرتبطة الريبوسوم بواسطة TCA هطول، تليها النشاف الغربية، في حين أن البروتين المجمعات المرتبطة الريبوسوم ويمكن immunoprecipitated من الكسور التدرج وتحليلها بواسطة النشاف الغربية أو مطياف الكتلة. والقصور من هذه التقنية هو أن التدرج البطيء طريقة الكسر يمكن أن يؤدي إلى تفكك البروتينات حتى بإحكام التي هي في السريع النقابية / تفارق حركية ملزمة. العوامل المرتبطة البروتينية حديثا توليفها أمثلة نموذجية. البروتينية حديثا توليفها الناشئة تشكل ريبوسوم يمكن أن يجمد على مجمعات البروتين المرتبطة باستخدام ريبوسوم عبر linkers الكيميائية مثل 3، 3&#39;-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. وكشف هذا النهج أن مستقبلات لC المنشط كيناز 1 (RACK1) / ج يونيو كيناز N-محطة (JNK) / ترجمة حقيقية النواة عامل استطالة 1A2 (eEF1A2) معقدة ينظم تدهور البروتينية حديثا توليفها ردا على التأكيد 27. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام منهجية مماثلة في الدراسات التي تبين أن بروتين كيناز C BII (PKCbII) يتم تجنيدهم للريبوسوم بواسطة RACK1 32 وأن تفعيل mTOR معقدة 2 (mTORC2) يحدث على ريبوسوم حيث phosphorylates البروتينية AKT توليفها حديثا وينظم لهم الاستقرار 33،34. القيود الرئيسية للأسلوب polysome تجزئة تليها تحليل انوتا هي: 1) شرط وجود عدد كبير نسبيا من الخلايا (~ 15 × 10 6 خلايا)، 2) عدم وجود معلومات بشأن الموضعية توطين الريبوسوم على جزيء الرنا معين، و 3 ) القضايا المتعلقة مغاير الخلوية والجزيئيةgeneity من الأنسجة الطبيعية والورم. القضايا المتعلقة عدد الخلايا المطلوبة يمكن حلها عن طريق مواءمة قمم أطياف الامتصاصية الموافق monosomes (80S) من الخلايا التي تحد مع تلك التي تم الحصول عليها من خلايا عالية فرة (مثل خلايا هيلا) 35 المبالغ. تقنية التنميط الريبوسوم (انظر أدناه) يمكن استخدامها لتحديد الموضع الدقيق من الريبوسوم على جزيء الرنا معين، في حين تتم مناقشة القضايا المتعلقة آثار الخلط من التجانس الأنسجة على تفسير التغيرات في التعبير الجيني تم الحصول عليها من الأنظمة المعقدة مثل الأنسجة البشرية بالتفصيل في منشور من قبل الكراث وستوري 36. مؤخرا، تم تطوير تقنية التنميط الريبوسوم الرواية، حيث يتم إنشاء الريبوسوم المحمية شظايا (الإقليمي للأمن الغذائي) عن طريق العلاج ريبونوكلياز أنا وتحليلها بواسطة أعماق تسلسل 22. هذه التقنية تسمح بتحديد موقف الريبوسوم في قرار النوكليوتيدات واحد، وبالتالي توفير unpr حتى الآنرؤى ecedented في البيولوجيا الريبوسوم. على سبيل المثال، التنميط الريبوسوم يمكن أن تستخدم لتحديد الكثافة الريبوسوم على جزيء الرنا معين أو تحديد العناصر التي معدلات الترجمة النفوذ بدء مثل مواقع بديلة البدء، البدء في الكودونات غير AUG-والعناصر التنظيمية مثل uORFs. ومع ذلك، هناك العديد من القيود المنهجية التي تحد من قدرة التنميط الريبوسوم إلى تقدير دقيق كفاءة ترجمة مرنا. وتشمل هذه التحيزات مستقلة عرضته تجزئة عشوائية وأنا ريبونوكلياز الهضم، والتحيزات التي أدخلها مثبطات الترجمة (مثل مثبطات استطالة مثل إيميتين وسيكلوهيكسيميد من المرجح أن تحفز تراكم الريبوسوم في مواقع بدء الترجمة)، وعدد كبير من النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة المرتبطة مع عشرات TE فضلا عن عدم دقة في التنبؤ يقرأ التي تنشأ من البروتين الترميز mRNAs و37. ربما الأهم من ذلك، في حين أنالتنميط الريبوسوم يسمح التعرف المباشر على موقف الريبوسوم جزيء الرنا معين، ويقدر عدد ريبوسوم الذي يرتبط مع مرنا تعطى بشكل غير مباشر عن طريق تطبيع الترددات من يقرأ في الإقليمي للأمن الغذائي (المرتبطة الريبوسوم مرنا) أكثر من تلك التي لوحظت في mRNAs ومجزأة بشكل عشوائي (مجموع مرنا). على سبيل المثال، سوف في إعداد بسيطة حيث احتلت أربعة &quot;B&quot; جزيئات مرنا (با، ب ب، قبل الميلاد ودينار بحريني) من قبل أربعة ريبوسوم في المواقف 1 و 2 و 3 و 4، والقصور الكامنة في أسلوب التنميط الريبوسوم لا تسمح التمييز بين سيناريو حيث ربط جميع ريبوسوم 4 فقط مع با مرنا في المواقف 1، 2، 3، و 4 وسيناريو حيث با، ب ب، قبل الميلاد و BD مرنا والمحتلة من قبل كل واحد الريبوسوم في الموضع 1، 2 ، 3، و 4، على التوالي. في المقابل، خلال polysome تجزئة، هو الحفاظ على سلامة polysome، مما يسمح عزل برك من mRNAs ويرتبط مع عدد محدد من ريبوسوم (الشكل 1). هذا الاستيرادالتمييز بين النمل تجزئة polysome والتنميط الريبوسوم يوحي بأن في حين أن الأسلوب السابق يمكن استخدامها لمقارنة مباشرة في mRNAs وmRNP، وعلى ضوء polysome الثقيلة الكسور، ومن المرجح أن تفشل الأسلوب الأخير لالتقاط التغيرات في translatome التي تنتج عن mRNAs والتي تمر بمرحلة انتقالية من ضوء لpolysomes الثقيلة، في حين تبالغ في تقدير مساهمة تلك التي تنتقل من جزء mRNP لpolysomes الثقيلة. وشدد على الأهمية البيولوجية لهذه التناقضات بين الطرق المذكورة أعلاه من قبل مجموعة كبيرة من البيانات التي تبين أن تفعيل متعدية من مجموعة فرعية من mRNAs ومثل تلك التي هي حساسة للeIF4E، والانتقال من الضوء إلى polysomes الثقيلة، في حين أن آخرين، مثل تلك التي تؤوي عناصر 5&#39;TOP، يتم تجنيدهم للpolysomes الثقيلة مباشرة من أحواض خالية من الريبوسوم مرنا 6. ومن المثير للاهتمام، وقد تبين مسار mTOR لتعديل متزامنة ترجمة &quot;تراعي eIF4E&quot; و5&#39;TOP mRNAs و11. لذلك، والاختلافات المنهجية التي تمت مناقشتها أعلاه قد يفسر التعارض الواضح إبرام بين الدراسات باستخدام التنميط الريبوسوم 38،39 وpolysome تجزئة 24 إلى تقييم آثار mTOR تثبيط على translatome. في الختام، تجزئة polysome والتنميط الريبوسوم طرق التكميلية التي تقدم في المقام الأول المعلومات فيما يتعلق بعدد من الريبوسومات المرتبطة مرنا وموقف الريبوسوم على مرنا، على التوالي. الأهم من ذلك، على الرغم من أوجه القصور ومزايا هذه الأساليب، يبقى من الضروري أن البيانات على نطاق الجينوم التي حصل عليها كل من الإجراءات ويتم تحليل كاف والتحقق من صحتها وظيفيا وكيميائيا.

الشبكات التنظيمية التي تتحكم في التعبير الجيني تم دراستها على نطاق واسع في العقدين الماضيين. الغالبية العظمى من هذه الجهود البحثية التي تركز على تنظيم النسخي، حيث كانت تستخدم التغييرات في مستويات مرنا حالة مستقرة على نطاق الجينوم واسعة لتحديد ما يسمى محات &quot;التعبير الجيني&quot;. تكشف الدراسات التي أجريت مؤخرا أن مستويات مرنا الحالة المستقرة تتوافق فضفاضة فقط إلى تكوين بروتيوم 1،2، مما يشير إلى أن آليات ما بعد النسخي، بما في ذلك الترجمة مرنا، ولعب دورا رئيسيا في تنظيم التعبير الجيني 3،4. في الواقع، تشير التقديرات إلى أن ~ يتم تحديد 50٪ من مستويات البروتين على مستوى الترجمة مرنا في الخلايا الليفية الماوس مخلد 5. ترجمة مرنا هو عملية منظمة للغاية حيث يتم ترجمتها إلى بروتينات mRNAs وعبر إجراءات مدبرة من ريبوسوم، الرنا نقل (tRNAs) وعوامل التبعية المشتركيشار إلى mmonly كعوامل الترجمة (تي إف إس) 6. تخليق البروتين هو الأكثر عملية والطاقة المستهلكة في خلايا الثدييات 7 وبالتالي يتم تعديل معدلات ترجمة مرنا العالمية لاستيعاب توافر المواد الغذائية ومعدلات تكاثر الخلايا 8. بالإضافة إلى تغيرات في المعدلات العالمية ترجمة مرنا، ومختلف المحفزات خارج الخلية (مثل الهرمونات وعوامل النمو)، العظة داخل الخلايا (على سبيل المثال مستويات الأحماض الأمينية) وأنواع مختلفة من الإجهاد (مثل ER-الإجهاد) تحدث تغييرات انتقائية في برك من mRNAs والتي هي يتم ترجمتها (translatome) 6. اعتمادا على نوع من التحفيز، النشاط ترجمة بعض، ولكن لا تتأثر جميع mRNAs وبشكل كبير، مما يؤدي إلى تغييرات في بروتيوم المطلوبة لجبل استجابة الخلوية السريع 6. ويعتقد أن هذه التغييرات النوعية والكمية في translatome أن بوساطة التفاعل بين العوامل العابرة المفعول (على سبيل المثال </م&gt; مكونات الآلات متعدية، والعوامل المساعدة أو miRNAs) ورابطة الدول المستقلة العناصر (عناصر الحمض النووي الريبي أو ميزات) موجودة في مجموعات فرعية مختارة من mRNAs و6،9. على سبيل المثال، والتغيرات في مستويات و / أو نشاط منظم معدل الترجمة الشروع العوامل eIF4E وeIF2 تعدل بشكل انتقائي ترجمة النصوص استنادا إلى الميزات 5&#39;UTR محددة 6. ويلزم eIF4E وeIF2 لتوظيف مرنا والبادئ الحمض الريبي النووي النقال إلى الريبوسوم، على التوالي 6. زيادة في النشاط eIF4E يعزز بشكل انتقائي ترجمة mRNAs وإيواء 5&#39;UTRs طويلة ومنظم للغاية بما في ذلك انتشار وبقاء ترميز البروتينات بما في ذلك تحفيز الحلقيات، ج MYC وبي سي إل XL 10. في المقابل، من تعطيل eIF2 يؤدي إلى تخليق البروتين العالمية الغلق، في حين يصل انتقائي تنظيم ترجمة mRNAs وتحتوي قصيرة المثبطة المنبع إطارات القراءة المفتوحة (uORFs) في 5&#39;UTRs الخاصة بهم، مثل تلك ترميز سيد رranscriptional المنظمين للاستجابة البروتين تكشفت (على سبيل المثال ATF4). في استجابة للمؤثرات المختلفة بما في ذلك المواد الغذائية، وعوامل النمو والهرمونات، والهدف الآلي / الثدييات rapamycin (mTOR) مسار يحفز النشاط eIF4E بواسطة تعطيل البروتين 4E ملزم (4E-BP) عائلة من المكثفات الترجمة، في حين أن مسار MAPK phosphorylates مباشرة eIF4E 6،11. بدوره، تحركات eIF2α (أي PERK، PKR، HRI وGCN2) تمنع eIF2 بواسطة phosphorylating الوحيدات التنظيمية eIF2α في الاستجابة للحرمان المغذيات، ER-الإجهاد وعدوى فيروس 6،12. تغييرات في النشاط و / أو التعبير عن TFS، وقد لوحظ مكونات أخرى من الآلات متعدية والعوامل التنظيمية بما في ذلك miRNAs في مختلف الحالات المرضية بما فيها السرطان، متلازمات الأيض، والاضطرابات العصبية والنفسية، وأمراض الكلى والقلب والأوعية الدموية 13-19. بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن متعدية ليchanisms تلعب دورا محوريا في الحفاظ على التوازن الخلية والتي إبطالهما يلعب دورا محوريا في المسببات لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. هنا، يوصف بروتوكول للتجزئة من قبل polysomes السكروز كثافة الطرد المركزي التدرج في خلايا الثدييات، والذي يستخدم لفصل polysomes من monosomes، مفارز الريباسي وجزيئات بروتين نووي ريبوزي رسول (mRNPs). وهذا يتيح التمييز بين تترجم بكفاءة (المرتبطة polysomes الثقيلة) من سوء ترجمة (المرتبطة polysomes ضوء) mRNAs و. في هذا الاختبار، وثبتوا على ريبوسوم مرنا باستخدام مثبطات ترجمة استطالة مثل سيكلوهيكسيميد 20 ويتم فصل مقتطفات عصاري خلوي على 5-50٪ سكروز الخطية التدرجات كثافة من قبل تنبيذ فائق. تجزئة اللاحقة من التدرجات السكروز يسمح عزلة mRNAs وفقا لعدد من الريبوسومات التي ربط. يمكن الحمض النووي الريبي المستخرج من كل جزء ثم استخدامها لتحديدتغييرات في توزيع mRNAs وعبر التدرج بين ظروف مختلفة، حيث يزيد كفاءة متعدية من أعلى إلى أسفل التدرج. وتستخدم شمال التنشيف أو الكمي عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR) لتحديد مستويات mRNAs وفي كل جزء. بدلا من ذلك، يتم تجميع الكسور التي تحتوي على polysomes الثقيلة (عادة أكثر من 3 ريبوسوم) ويتم تحديد مستويات مرنا المرتبطة polysome على نطاق الجينوم باستخدام ميكروأري أو العميقة التسلسل. فإنه من الأهمية بمكان التأكيد على أن مستويات mRNAs والمرتبطة polysome هي، بالإضافة إلى الترجمة، تتأثر آليات النسخي وبعد النسخي التي تؤثر على مستويات mRNAs وعصاري خلوي 21. لذلك، لتحديد الاختلافات في الترجمة باستخدام بيانات الجينوم على نطاق من المصاحب polysome مرنا فمن الضروري لتصحيح آثار من الخطوات في هذا الجين التعبير المسار التي هي المنبع من transla21 نشوئها. للسماح مثل هذا التصحيح، ويتم إعداد الحمض النووي الريبي عصاري خلوي بالتوازي مع الحمض النووي الريبي المرتبطة polysome من كل عينة ومستويات مرنا حالة مستقرة على نطاق الجينوم ويتم تحديد 21. حاليا، ما يسمى ب &quot;الترجمة الكفاءة&quot; (TE) عشرات (أي بين نسبة سجل بين البيانات مرنا المرتبطة polysome والبيانات مرنا عصاري خلوي) غالبا ما تستخدم لتصحيح آثار التغيرات في مستويات مرنا عصاري خلوي على كفاءة ترجمة ل نظرا مرنا 22. ومع ذلك، باستخدام عشرات TE لتحديد الفرق الترجمة يرتبط مع أعداد كبيرة من النتائج الإيجابية الكاذبة والسلبية الكاذبة بسبب خاصية رياضية من عشرات TE يشار إلى علاقة زائفة إلى 27. في الواقع أشارت دراسة استقصائية لمجموعات البيانات من مختبرات متعددة أن مثل هذه الارتباطات الزائفة ويبدو أن لا مفر منه عند تحليل التغيرات في translatomes 23. دفع هذا التطور من &quot;تحليل الفرق آر<html> anslation &quot;(انوتا) الخوارزمية، والتي لا تعاني من أوجه القصور المذكورة أعلاه 23. انوتا خلال التحليل تم استخدام نموذج الانحدار لاستخلاص التدابير النشاط متعدية مستقلة عن مستويات الحمض النووي الريبي عصاري خلوي. هذه التدابير ثم مقارنة بين الظروف ويحسب الإحصاءات. المستخدم لديه خيار تطبيق طريقة انكماش التباين، مما يحسن القدرة الإحصائية، ويقلل من حدوث نتائج إيجابية كاذبة في الدراسات القليلة مع مكررات 24. بشكل ملحوظ، وقد تجلى ذلك مؤخرا ان الاضطرابات في translatome استولت عليها انوتا، ولكن ليس عشرات TE، ترتبط التغييرات في بروتيوم 25. لذلك، ينصح بشدة لتطبيق التحليل انوتا لتحديد التغييرات في الترجمة على نطاق الجينوم واسعة. في حين تمت مناقشة الأسس النظرية من الخوارزمية انوتا بالتفصيل سابقا 21،23،26، وهنا يتم التركيز على كيفية تطبيقه في الواقع العملي. ve_content &quot;&gt; وبالإضافة إلى دراسة التغيرات في نشاط الترجمة مرنا في الخلية، وهذا البروتوكول تجزئة الريبوسوم يمكن استخدامها لعزل وكيميائيا ووظيفيا تميز الريبوسوم والمرتبطة polysome المجمعات البروتين. تمت بنجاح تم نشر هذا النهج في الماضي لتحديد المجمعات التي تنظم استقرار البروتينية حديثا توليفها 27 و / أو تشارك في الفسفرة من مكونات الآلات متعدية. كما سيتم مناقشة هذا تطبيق طريقة polysome تجزئة لفترة وجيزة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

ترجمة مرنا يلعب دورا محوريا في تنظيم التعبير الجيني ويمثل أكثر عملية والطاقة المستهلكة في خلايا الثدييات. وفقا لذلك، وتعتبر التقلبات الترجمة مرنا للعب دور رئيسي في مجموعة متنوعة من الحالات المرضية بما فيها السرطان. ريبوسوم أيضا استضافة المحرمين، والتي تسهل للطي من البروتينية الوليدة، وبالتالي تحوير وظيفة واستقرار البروتينية توليفها حديثا. بالإضافة إلى ذلك، تشير إلى أن البيانات الناشئة ريبوسوم بمثابة منصة لذخيرة من إشارات الجزيئات، التي تورطت في مجموعة متنوعة من التعديلات بعد متعدية من البروتينية حديثا توليفها لأنها تخرج من الريبوسوم، و / أو مكونات الآلات متعدية. هنا، يتم وصف طريقة راسخة من تجزئة الريبوسوم باستخدام كثافة السكروز التدرج الطرد المركزي. بالتزامن مع تطوير خوارزمية &quot;انوتا&quot; لفي المنزل يسمح هذا الأسلوب تقرير مباشر من diffeترجمة رينتيال من mRNAs والفردية على نطاق الجينوم واسعة. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول تنوعا يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات البيوكيميائية التي تهدف إلى تشريح وظيفة من المجمعات البروتين المرتبط الريبوسوم، بما في ذلك تلك التي تلعب دورا محوريا في للطي وتدهور البروتينية توليفها حديثا.

mTOR هو العقدة الرئيسية في الشبكة الخلوية التي تنسق معدلات تخليق البروتين العالمية مع توافر المواد الغذائية 19. وينظم الترجمة مرنا بشكل رئيسي في بدء خطوة الحد من معدل 6. نسبة ريبوسوم تشارك في polysomes يرتبط بشكل إيجابي مع معدلات ترجمة الشروع 28. ويقدم مثالا على تطبيق طريقة polysome تجزئة للتحقيق في دور mTOR الإشارات في التوسط آثار الانسولين على ترجمة مرنا. تحقيقا لهذه الغاية، تم الحفاظ MCF7 خلايا سرطان الثدي البشرية في البلدان المنخفضة المصل ومن ثم حفز مع الانسولين وحدها أو بالاشتراك مع موقع نشط mTOR المانع Torin1. حفز الخلايا غير التي تم الاحتفاظ بها باستمرار في انخفاض مصل، وكان بمثابة السيطرة. تم فصل mRNPs، صبغي جنسي أحادي (80S) والكسور polysome باستخدام طريقة polysome تجزئة. نسبة إلى الخلايا السيطرة، بفعل الأنسولين زيادة في الامتصاصية في الكسور التدرج المقابلةلpolysomes، يقابله انخفاض مصاحبة في الامتصاصية في جزء صبغي جنسي أحادي (الشكل 1). تظهر هذه النتائج أن نسبة ريبوسوم تشارك في polysomes يتم زيادة الأنسولين في علاجها بالمقارنة مع الخلايا السيطرة، وبالتالي تشير إلى أن، كما هو متوقع، والانسولين يحفز معدلات ترجمة الشروع العالمية. عكس Torin1 آثار الانسولين على ملامح الامتصاصية (الشكل 1)، وبالتالي مؤيدة النتائج أن mTOR الإشارات يلعب دورا رئيسيا في التوسط آثار الانسولين على آلية ترجمة 19. استنادا إلى مبدأ أن عدم الاتساق في إعداد التدرج لا يمكن تجنبها، وقد أثيرت تساؤلات بشأن استنساخ البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام طريقة التجزئة polysome 22. تجريبيا لاختبار هذه المسألة يحتمل أن تكون ضارة، عصاري خلوي والثقيلة المرتبطة polysome الحمض النووي الريبي (مرنا يرتبط مع 4 وأكثر ريبوسوم) كانت معزولة<html> من خلايا MCF7 تعامل مع الانسولين وحدها أو بالاشتراك مع الأنسولين Torin1 من 4 مكررات البيولوجية المستقلة (الشكل 2). تم تحديد آثار الانسولين وTorin1 عن تكوين عصاري خلوي والثقيلة مرنا المرتبطة polysome في كل تكرار على نطاق الجينوم واسعة باستخدام نهج ميكروأري. لتحديد استنساخ الأسلوب polysome تجزئة تم تطبيق تحليل المكون الرئيسي (PCA). وأظهر هذا التحليل أن العينات تنتمي إلى كل حالة ووضع بإحكام داخل اثنين من المكونات الأولى في حين أن ظروف مختلفة تم فصل جيدا (الشكل 2). تظهر هذه النتائج أن طريقة polysome تجزئة كما هو موضح هنا هو تكرار للغاية، وبالتالي مناسبة لدراسة التغيرات الكمية والنوعية في الترجمة على مستوى الجينوم على نطاق. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. محات Polysomal تظهر آثار المجاعة في الدم، والانسولين وmTOR يشير على الترجمة العالمية في الخلايا MCF7. حرمت الخلايا MCF7 من المواد الغذائية (0.1٪ في المحافظة FBS) لمدة 16 ساعة وتعامل مع 5 نانومتر الأنسولين (شهيق) وحدها أو في تركيبة مع 250 نيوتن متر Torin1 (شهيق + Torin1) لمدة 4 ساعات. واستخدمت الخلايا غير المعالجة والتي حرمت باستمرار من المواد الغذائية (0.1٪ FBS) كمجموعة تحكم. تم الرسوبية مقتطفات عصاري خلوي المقابلة بواسطة الطرد المركزي على 5-50٪ التدرجات السكروز. يشار إلى مفارز الريباسي الحرة (40S 60S و)، monosomes (80S) وعدد من الريبوسومات في الكسور polysome. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> الشكل 2. بيانات الجينوم على نطاق الحصول عليها باستخدام عolysome التنميط هو تكرار للغاية، وعولجوا خلايا MCF7 كما في الشكل 1 تم استخراج. عصاري خلوي والمرتبطة polysome الحمض النووي الريبي (&gt; 3 ريبوسوم) من 4 مكررات البيولوجية مستقلة ومستوياتها مرنا على نطاق الجينوم كانوا مصممين باستخدام صفائف GeneTitan ([أفمتريإكس]). وقد استخدم PCA لتقييم استنساخ البيانات الناتجة. المعروضة هي أول عنصرين PCA لجميع العلاجات (T1 = 1 في Torin؛ السيطرة = السيطرة؛ شهيق = الأنسولين)، والأصل من الحمض النووي الريبي (C = عصاري خلوي؛ P = المرتبطة polysome) ويعيد. يتم وضع عينات من نفس حالة والأصل RNA عن كثب مشيرا إلى استنساخ عالية.

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

ريبوسوم تلعب دورا محوريا في تخليق البروتين. Polyribosome (polysome) تجزئة من قبل السكروز التدرج الكثافة الطرد المركزي يسمح تقرير مباشر من الكفاءة ترجمة mRNAs والفردية على نطاق الجينوم واسعة. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة يمكن استخدامها لتحليل الكيمياء الحيوية من والريبوسوم عوامل المرتبطة polysome مثل المحرمين وجزيئات الإشارة.

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

في تقطير التحت خلوية الموقع من خلايا الثدييات وغير ملتصقة منتسب -

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

الجينوم على نطاق تحليل المستويات (شحن) من الحمض الريبي النووي النقال باستخدام Aminoacylation ميكروأرس]

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

الجينوم على نطاق التحليل باستخدام رقاقة لتحديد أهداف محددة الجينات شكل الإسوي

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

مقياس الهاتفي للثقافة خلايا الثدييات باستخدام قارورة جديد متعدد الطبقات

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

رواية النظرية الافتراضية تغيير نقطة حسابي لتحليل الجينوم-اسعة من أنواع البيانات المتنوعة ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...