Name: polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research Grant (CIHR MOP-115195) og FRQ-S til det, der er også en modtager af CIHR Young Investigator Award; og det svenske forskningsråd og den svenske Cancer Society til OL

1. Saccharosegradient Fremstilling <ol><li> Forbered 100 ml 60% (w / v) sucroseopløsning i Hedeselskabet 2 O. Opløsning skal filtreres gennem et 0,22 um filter for at forhindre tilstopning af slangen under fraktionering (trin 3.5). </li><li> Forbered 5 ml 10x saccharosegradient buffer: 200 mM HEPES (pH 7,6), 1 M KCI, 50 mM MgCI2, 100 pg / ml cycloheximid, 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free), 100 enheder / ml RNase inhibitor. </li><li> Ved hjælp af 60% opløsning fremstillet som beskrevet i trin 1.1, at 40 ml af 5% og 50% saccharose løsninger i 1x saccharosegradient puffer. </li><li> Brug markør blok forsynet med gradienten maker at markere halvfuld punkt på hver polyallomer ultracentrifugering rør til lagdeling (6 ultracentrifugering rør i alt). Brug af lagdeling anordning med gradienten maker, der tilsættes 5% saccharose-opløsning, indtil den når den halvt fuld punkt. Derefter tilsættes 50% rørsukkeropløsning fra bunden, indtil interfes mellem de to løsninger, når den halve fuld point. Særlig forsigtighed bør tages under dette trin, således at gradienter er så ens som muligt, da dette er afgørende for at opnå høj reproducerbarhed (se nedenfor). </li><li> Seal rør med rente zoneinddeles hætter leveres med gradienten maker og overføre de forseglede rør til indehaveren røret på gradient maker. </li><li> Kør gradient maskine for at opnå en lineær 5% til 50% gradient. 6 lineære forløb vil blive dannet på få minutter ved rotation ved høj tilt vinkel. Bemærk: saccharosegradienter kan anvendes straks eller opbevares ved -80 ° C i 6 måneder. </li></ol> 2.. Isolering og Sedimentation af Polysomer <ol><li> Afhængigt af celletype, frø celler i 1-5 15-cm petriskåle (~ 15 x 10 6 celler) mindst én dag før lysering. På dagen for eksperimenterne celler skulle være ~ 80% sammenflydende. <!-- Bemærk: Optimal sammenflydning er kritisk, fordi oversættelse og opformeringsrater er direkteproportionale 8, og derfor polysomerne bør analyseres i aktivt prolifererende celler (dvs. oversættelse satser vil markant falde i løbet af sammenflydende celler, mens lav konfluens af celler ikke kan tilvejebringe tilstrækkeligt materiale til videre analyse). Undtagelser fra denne regel kan gøres hvis for eksempel forsøgslederen er interesseret i at studere effekten af ​​kontakt hæmning på oversættelse. Imidlertid bør celler ikke holdes under løbet sammenflydende betingelser for længe, ​​da det kan have utilsigtede virkninger på translatome. Hvis transfektion er påkrævet, har de fleste af de kommercielt tilgængelige kits ikke påvirke polysom ​​niveauer. Fordi på dagen for transfektion celler skal være 80-90% sammenflydende, anbefales det at udbrede celler 24 timer efter transfektion og isolere polysomer 48 timer efter transfektion af celler ~ 80% sammenflydende. </li><li> Cellerne inkuberes med cycloheximid til en slutkoncentration på 100 ug / ml i vækstmedier i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO 2; og vaskes cellerne to gange med 10 ml iskold 1x PBS indeholdende 100 ug / ml cycloheximid. Cycloheximid er en oversættelse forlængelse inhibitor, &quot;fryser&quot; ribosomer til mRNA og derved forhindre ribosom afstrømning 20. </li><li> Skrab celler forsigtigt i 5 ml iskold 1x PBS indeholdende 100 ug / ml cycloheximid og samle dem i et 50 ml rør. Det er vigtigt, at dette trin udføres rimeligt hurtigt som forlader cellerne på is i en længere periode vil drastisk nedsætte kvaliteten af ​​præparatet polysom. </li><li> Saml cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C. </li><li> Supernatanten kasseres, og resuspender cellerne i 425 pi hypotonisk puffer [(5 mM Tris-HCI (pH 7,5), 2,5 mM MgCl2, 1,5 mM KCI og 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)] tilsættes 5 ul 10 mg / ml CHX, 1 pi 1 M DTT, 100 enheder RNAse-inhibitor og vortex i 5 sekunder efterfulgt af tilsætning af 25 ul af 10% Triton X-100 (slutkoncentration 0,5%) og 25 pi 10% natriumdeoxycholat (slutkoncentration 0,5%) og vortex i 5 sek. Grundet celle hævelse, vil hypotonisk puffer forstyrre plasmamembranen, mens de milde detergent betingelser anvendes til at opløseliggøre cytosol og endoplasmatisk reticulum-associeret ribosomer uden at forstyrre kernemembranen. </li><li> Centrifugér lysater ved 16.000 x g i 7 min ved 4 ° C og overførsel supernatant (~ 500 pi) til et nyt præ-kølet 1,5 ml rør. Måle OD ved 260 nm for hver prøve ved anvendelse af et spektrofotometer og holde 10% af lysatet som input, der vil blive anvendt til at bestemme cytosoliske steady-state-mRNA-niveauer. Fortynd input til 750 pi i RNAse free H2O, tilsættes 750 pi Trizol og flash fryse i flydende nitrogen. </li><li> Overfør ultracentrifugerør indeholdende saccharosegradienter i pre-kølet rotor spande. Fjern 500 pi fra toppen af ​​saccharosegradienter. Juster lysater så de indeholder de samme OD (10-20 OD ved 260 nm) i 500 pi lysisbuffer (beskrevet i trin 2.5) og indlæse dem på hver saccharosegradienten. Bemærk: Det er vigtigt straks at indlæse lysater på gradienter, da dette kritisk vil forbedre kvaliteten af ​​polysom ​​præparater. </li><li> Afvejes og balance hver gradient før den ultra-centrifugering. </li><li> Centrifugeres ved 222.228 xg (36.000 rpm) i 2 timer ved 4 ° C under anvendelse SW41Ti rotor. Bemærk: For ikke at forstyrre sucrosegradienter, skal der vælges &quot;lav&quot; bremse mulighed. </li></ol> 3.. Polysomprofiler Fraktionering og RNA-ekstraktion <ol><li> Forbered fraktionsopsamleren ved at rense den med varmt RNAse gratis vand indeholdende RNase ZAP (et par spray). Gentag dette trin med varmt RNAse gratis kun vand. Skift UV-lampe og vente på grønt lys til at blive vist. </li><li> Fjern forsigtigt rørene fra rotoren og læg dem på is. Tænd computeren, pumpe, UV-detektor og fraktion samler. Indstil pumpen ved 3 ml / min, og fill slangen med jager-opløsning [60% (w / v) saccharose indeholdende 0,02% (w / v) bromphenolblåt], indtil den når nålen. Sørg for at se mindst en dråbe kommer ud af nålen, og sikre, at ingen bobler indføres i pumpen sprøjten eller slange. </li><li> Placer 2 ml rør i en brøkdel samler. Launch analyse program og indstille følsomheden til + / - 10 MeV. Indstil &quot;timebase&quot; til 100 sek. </li><li> Placer hver ultracentrifugation rør ind i UV-detektor samtidig sikre, at røret er i den retvinklede stilling. Gennembore rør med kanylen ved at dreje knappen nedenfor indehaveren røret. </li><li> Indstil pumpen ved 1,5 ml / min og samle fraktionerne fastsætter tidspunktet til 30 sek om fraktionsopsamler (dette vil resultere i ~ 750 ul i hver fraktion). Sæt pumpen i &quot;remote position&quot;, starter pumpen og fraktionsindsamler, og samtidig begynde at optage ved hjælp af DAQ sporstof. Dette vil starte en opadgående forskydning af saccharose graenser og en samtidig detektering af UV-absorbans ved 254 nm. Stop indsamling, så snart den første dråbe jagter løsning falder i et 2 ml indsamler rør. </li><li> Gem sporing i CSV-format, og (når trin 3.7 er gennemført), i et regnearksprogram, skal du gøre følgende for at identificere placeringen af ​​hver fraktion i UV-absorbans profilen.: <ol><li> Vælg den kolonne, der indeholder værdier, der svarer til absorbansen ved 254 nm (kanal 0). </li><li> Opret en jævn linje scatter plot af absorbanserne. </li><li> Indstil større enhed af X-aksen til 300 (værdien opnås ved at dividere mængden af ​​5% -50% saccharosegradient (~ 12 ml) ved samling for hver fraktion (30 sek.) </li></ol></li><li> Tilføj 750 pi Trizol i hver fraktion og flash fryse fraktionerne i flydende nitrogen. </li><li> Isoler polysom-associeret og cytosol (fra 2.6) RNA ved hjælp Trizol protokol i henhold til producentens anvisninger. For at øge RNA udbytte, fortsæt med RNA præcisionpitation ved -80 ° C i 30 min eller -20 ° C natten over. Bemærk: Da mængden af ​​RNA udfældes fra polysomalt fraktioner må ikke være tydeligt synlige, anbefales det at tilføje luftfartsselskab. Tilsæt 1 pi bærer til røret før RNA udfældningstrin under Trizol protokollen. </li><li> Bestem hvilke fraktioner svarer til mRNA forbundet med&gt; 3 ribosom (ved hjælp af beskrevne fremgangsmåde 3.6) og samle disse fraktioner. Brug RNA oprydning kit til at udføre oprensning af poolede polysom-associerede og cytosoliske RNA (fra 2,6). Indsend prøver til et anlæg til at bestemme genom-dækkende mRNA-niveauer ved hjælp af microarrays eller dyb-sekventering. Hvis oversættelsen af ​​specifikke mRNA&#39;er skal overvåges ved hjælp af RT-qPCR, anbefales det at anvende 500 ng RNA (fra puljede fraktioner indeholdende&gt; 3 ribosomer eller total RNA) at syntetisere cDNA. Bemærk: mRNAer forbundet med&gt; 3 ribosomer er sat arbitrært at repræsentere effektivt oversatte mRNAs og indeholder mere end 80% af nyligt deres syntesemellemstore polypeptider 28,29. Herunder fraktioner svarende til lys (1-2), medium (2-3) og tunge polysomer (&gt; 3) ville være en fordel, men disse vil øge antallet af prøver med 2-fold (4 vs 2 pr betingelse), og dermed omkostninger af eksperimentet. Uanset at det forventes, at faldet i omkostningerne til dyb-sekventering og microarray analyse i fremtiden bør favorisere sidstnævnte tilgang, anbefales det, at under valideringen, er fordelingen af ​​de enkelte mRNAs overvåges i hver fraktion. </li></ol> 4.. Genom-dækkende analyse af mRNA Translation <ol><li> Installer R BioConductor og anota pakke: <ol><li> Installer R (download fra r-project.org) og start en R-session. Bemærk: R er tilgængelig for alle operativsystemer og anota vil køre på dem alle. </li><li> Installer BioConductor (bioconductor.org). R-kode fortolkes gennem R-terminal (fx R-konsollen i Windows - der er lanceret af double klikke R genvej). BioConductor installeres ved at skrive (i R-terminal): kilde (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite () </li><li> Installér anota BioConductor pakken (og den qvalue pakke, anota kræver) ved at skrive (i R-terminal): kilde (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite (c (&quot;anota&quot;, &quot;qvalue&quot;)) </li><li> Test at pakken blev installeret, og åbn anota manualen ved at skrive (i R-terminal): bibliotek (&quot;anota&quot;) vignet (&quot;anota&quot;) </li><li> Bemærk: Yderligere hjælp til alle funktioner, der anvendes i anota pakke kan findes enten på anota webside (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) eller ved hjælp af hjælpefunktionen i R. For eksempel, for at få hjælp på anotaPerformQc funktionen gå til R-terminal og type (bemærk at dette kun fungerer, når anota pakken er blevet indlæst): bibliotek (&quot;anota&quot;) # indlæser anota pakke ? AnotaPerformQc # åbner hjælp til denne funktion </li></ol></li><li> Importer data til R: <ol><li> Forbered udtryk data til analyse. Data skal præ-behandlet (f.eks normaliseret og kvalitetskontrolleret) med hensyn til den teknik, der blev brugt til at måle mRNA niveauer. Input værdier skal logge transformeres, mest almindelige er log2. Kompiler en tabel med data for alle polysom-associerede RNA-prøver og én for alle cytosole RNA-prøver. Den første kolonne skal indeholde gen-identifikatorer efterfulgt af én data kolonne per prøve; den første række skal indeholde navne til prøverne. Det er afgørende, at tabellerne har identisk prøve orden og identisk gen orden. Gem filerne som tabulatorseparerede tekstfiler kaldet &quot;myPolysomeData.txt&quot; og &quot;myCytosolicData.txt&quot;. </li><li> I dette eksempel to prøve klasser er brugt (kontrol eller syge) med 3 gentagelser per klasse, og dermed generere 6 prøver med denne rækkefølge: C1, C2, C3, D1, D2, D3 i både myCytosolicData.txt og myPolysomeData.txt filer. Anota kræver mindst 3 gentagelser pr tilstand, når der er to prøve klasser. Disse bør være uafhængige biologiske gentagelser. </li><li> Opret en mappe, der indeholder input-data filer (myPolysomeData.txt og myCytosolicData.txt). Åbent R fra denne mappe. I Windows / Mac kan dette gøres ved at kopiere en R-genvej ind i denne mappe og lancering R bruger denne genvej (det arbejder direkte kan også ændres ved hjælp af drop-down menuer). </li><li> Opret en fil kaldet myCode.R inden den nyoprettede mappe og åbne den ved hjælp af et tekstbehandlingsprogram. Skriv koden i denne fil. </li><li> For at indlæse data i R skrive følgende kode til myCode.R fil (husk at re-gemme denne fil efter hver tilsætning af kode). Nedenfor er en trin-for-sTEP forklaring af kode, men al kode kan også skrives i første omgang og kilde funktion (der kører koden, se nedenfor), der anvendes kun én gang: # # Dette indlæser anota biblioteket bibliotek (anota) # # Dette indlæser indtaste data i R dataCyto &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myCytosolicData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, sep = &quot; t&quot;)) dataPoly &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myPolysomeData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, sep = &quot; t&quot;)) </li><li> Kør koden i R ved at skrive direkte i R-terminalen: kilde (&quot;myCode.R&quot;) </li><li> Kontrollér at de data blev indlæst med succes ved at skrive (i R-terminal): hoved (dataCyto) # viser toppen af ​​dataCyto bordet hoved (dataPoly) </li></ol></li><li> Identifikation af differentielt oversatte gener: <ol><li> Generer en vektor, der beskriverkategorierne prøve (en vektor er en type objekt i R). Denne vektor bør afspejle prøve orden i myPolysomeData.txt og myCytosolicData.txt så alle tre objekter har en identisk rækkefølge prøverne. Vektoren vil blive brugt, når instruere anota om, hvilke prøver at sammenligne. Tilføj følgende til myCode.R fil: # # Bemærk, at de udtages har identisk prøve klasse # # Beskrivelser (dvs. &quot;C&quot; eller &quot;D&quot;) i denne vektor. myPhenotypes &lt;- c (&quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;) </li><li> Udføre kvalitetskontrol af datasættet. Der er en række af kvalitet foranstaltninger, der skal vurderes, før anota kan bruges til analyse. Disse drøftes i detaljer i anota manual. Tilføj denne kode til myCode.R filen og gemme: anotaQcOut &lt;- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut &lt;- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Kør koden ved at skrive i R-terminal: kilde (&quot;myCode.R&quot;) Dette vil generere en række output-filer, som kan undersøges som anvist i anota manual. </li><li> Identificer differentielt oversatte gener. Prøverne vil blive sammenlignet på grundlag af alfabetisk rækkefølge navnene leveres til &quot;phenoVec&quot; parameter (dvs. &quot;myPhenotypes&quot; vektor), medmindre de er specificeret af brugeren (ved hjælp af &quot;kontraster&quot; parameter). Føj følgende kode til myCode.R fil og afslut ved at bruge kommandoen &quot;kilde&quot; inde i R-terminal, som beskrevet ovenfor: anotaSigOut &lt;- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Brug hjælpen til anotaGetSigGenes at forstå, hvordan output er formateret og se, hvordan du vælger prøve kategorier for at sammenligne ved at skrive (i R-terminal): ? anotaGetSigGenes </li><li> Filter og plot gener, der er forskelligt oversat. Der er flere tærskler, der kan anvendes inden for anotaPlotSigGenes funktion og brug af hjælp vil forenkle en brugerdefineret kombination af sådanne tærskler. Hvis du vil vælge for pålidelig analyserede gener anvender minSlope (-0,5), maxSlope (1.5) og slopeP (0,01) indstillinger. Bemærk: Ud over, indstillinger, der gælder for RVM 23,26,30 falsk opdagelse sats (FDR) (0,15) og fold ændringer (log2 [1.5]), kan fx bruges til at identificere differentielt oversatte gener. Andre filtre som &quot;selDeltaPT&quot; kan være nyttige for en strengere filtrering (fx indstilling selDeltaPT til log2 [1.5]). Det er også nødvendigt at præcisere, hvilke sammenligning skal filtreres (ved hjælp af selCont argument). Anvend de beskrevne indstillinger ved at tilføje følgende linje til myCode.Rfil: anotaSigFiltered &lt;- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1.5), selDeltaPT = log2 (1.5)) </li><li> Udføre analysen ved hjælp af kilden funktion fra R-terminale som beskrevet ovenfor. Dette vil også generere en grafisk output. Undersøgelse denne udgang er et godt udgangspunkt for at vurdere resultaterne af den analyse og identificere eventuelle nødvendige ændringer af indstillingerne. </li><li> Generer en output tabel. Føj følgende kode til myCode.R fil: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = &quot;MySignificantGenes.txt&quot;, sep = &quot; t&quot;) </li><li> Kør kode ved hjælp kilden funktion i R-terminalen. Kolonnerne i den resulterende tabel er forklaret i hjælpen til anotaPlotSigGenes funktionen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes:+a+systems+biology+view.">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li><li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells.">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases.">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li><li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways.">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation.">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li><li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease.">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer:+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways.">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li><li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease.">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li><li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+neurodegeneration:+role+and+impact.">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li><li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease.">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments.">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li><li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells.">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li><li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1.">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li><li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide.">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li><li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome.">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li><li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+translational+control+in+CD4++T+cell+subsets.">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13 (2013).</li><li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis.">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li><li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins.">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li><li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Denne artikel beskriver en veletableret polysom ​​fraktionering protokol efterfulgt af en in-house udviklede analysemetode til at opfange kvalitative og kvantitative ændringer i translationel aktivitet på en genom-plan i pattedyrceller. For en vellykket gennemførelse af denne protokol, særlig opmærksomhed bør rettes mod 1) cellekonfluens (som spredning priser og tilgængeligheden af ​​næringsstoffer korrelerer med mRNA oversættelse aktivitet og kan påvirke sammensætningen af ​​translatome bør cellekonfluens være konsekvent i hele gentagelser og eksperimentelle forhold), 2) Hurtig cellelysering (Uanset tilstedeværelsen af ​​cycloheximid og RNAse inhibitorer i buffere bør lysis være hurtig og cellulære ekstrakter bør oven på sucrosegradienter umiddelbart efter lysis at forhindre RNA-nedbrydning og dissociation af polysomer), 3) Gradient forberedelse (for at sikre høj data reproducerbarhed bør saccharosegradienter blive udarbejdet ved hjælp af gradient maker og spebør tages sielle forsigtig, når du håndterer dem). Ud over at studere ændringerne i translationel aktivitet, kan denne protokol anvendes til at isolere ribosom-associeret protein-komplekser og fastlægger deres fysiologiske funktioner. Til dette formål kan niveauer og phosphoryleringsstatus af forskellige ribosom-associerede proteiner bestemmes ved TCA-præcipitation, efterfulgt af Western-blotting, mens ribosom-associerede protein-komplekser kan immunopræcipiteret fra gradientfraktioner og analyseret ved Western blotting eller massespektrometri. En mangel ved denne teknik er, at den langsomme gradientfraktion metode kan resultere i dissociation af selv tæt bundne proteiner, hvis bindende kinetik i hastig forening / dissociation. Faktorer forbundet med nyligt syntetiserede polypeptider er typiske eksempler. Nyligt syntetiserede polypeptider nye danne ribosomerne kan immobiliseres på protein-komplekser, der er forbundet med ribosomer anvendelse af kemiske tværbindingsmidler, såsom 3, 3&#39;-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Denne fremgangsmåde har vist, at receptoren for Aktiveret C Kinase 1 (Racks1) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / eukaryot translation elongeringsfaktor 1A2 (eEF1A2) komplekset regulerer nedbrydning af nyligt syntetiserede polypeptider som reaktion på stress 27. Desuden blev samme metode anvendt i undersøgelser, der viser, at proteinet kinase C bii (PKCbII) er rekrutteret til ribosomer ved Racks1 32 og at aktivering af mTOR kompleks 2 (mTORC2) forekommer på ribosomer, hvor det phosphorylates nyligt syntetiserede AKT-polypeptider og regulerer deres stabilitet 33,34. Store begrænsninger af polysom ​​fraktioneringsmetode efterfulgt af anota analyse er: 1) kravet om et relativt højt antal celler (~ 15 x 10 6 celler), 2) manglende positionsinformation vedrørende lokalisering af ribosomet på et givet mRNA-molekyle, og 3 ) spørgsmål i relation til cellulære og molekylære heterohomogent normale og tumorvæv. Spørgsmål vedrørende krævede celle nummer kan løses ved at tilpasse absorbansspektre toppe svarende til monosomer (80S) af celler, hvis beløbene er begrænsende med dem, der opnås fra high-overflod celler (f.eks HeLa-celler) 35. Ribosom profilering teknik (se nedenfor) kan anvendes til at bestemme nøjagtige position af ribosomet på et givet mRNA-molekyle, mens spørgsmål vedrørende forstyrrende virkninger af væv heterogenitet om fortolkningen af ​​ændringer i genekspression opnået fra komplekse systemer, såsom humane væv diskuteres i detaljer i en publikation fra Leek og Storey 36. For nylig blev en hidtil ukendt ribosom profilering teknik udviklet, hvor ribosom beskyttede fragmenter (RPFs) genereres ved RNAse I-behandling og analyseret ved dyb-sekventering 22. Denne teknik muliggør bestemmelse af ribosomet position ved et enkelt nucleotid opløsning, for derved at tilvejebringe hidtil unprecedented indsigt i ribosomet biologi. For eksempel kan ribosom profilering, der skal anvendes til bestemmelse af ribosom densitet på et givet mRNA-molekyle eller identifikation af elementer, der påvirker oversættelse ammefrekvensen såsom alternative initierings-sites, initiering ved ikke-august kodoner og regulatoriske elementer, såsom uORFs. Men der er flere metodologiske begrænsninger, der begrænser muligheden for ribosomet profilering til præcist at estimere mRNA translation effektivitet. Disse omfatter uafhængige bias indført ved tilfældig fragmentering og RNAse I fordøjelse, fordomme indført ved translationsinhibitorer (f.eks forlængelsesegenskaber hæmmere såsom emetin og cycloheximid er tilbøjelige til at fremkalde ribosom ophobning ved translationsinitiering sites), et stort antal af falsk positive og falsk negative resultater er forbundet med TE scoringer samt deres unøjagtighed forudsige læser, der stammer fra protein kodning mRNAer 37. Måske vigtigst, hvorimodribosom profilering giver mulighed for direkte identifikation af ribosom stilling på et givet mRNA-molekyle, er antallet af ribosomer, som er forbundet med en given mRNA indirekte estimeret ved at normalisere frekvenser læser i RPFs (ribosom-associeret mRNA) i forhold til dem observeret i tilfældigt fragmenterede mRNAer (total mRNA). For eksempel vil en simpel indstilling, hvor fire &quot;B&quot; mRNA molekyler (BA, som BB, BC og BD) er besat af fire ribosomer på positionerne 1, 2, 3 og 4, en iboende mangel af ribosomet profilering teknik ikke tillade en skelnen mellem et scenarie, hvor alle 4 ribosomer forbinder kun med en Ba mRNA i positionerne 1, 2, 3, og 4, og et scenarie, hvor Ba, Bb, Bc og Bd mRNA hver besat af en enkelt ribosom i position 1, 2 , 3 og 4, hhv. I modsætning hertil, i polysom ​​fraktionering er polysom ​​integritet bevares, hvorved isolering af puljer af mRNA&#39;er, der er forbundet med et defineret antal ribosomer (figur 1). Denne important sondring mellem polysom ​​fraktionering og ribosom profilering antyder, at førstnævnte metode kan bruges til direkte at sammenligne mRNA&#39;er i mRNP, lette og tunge polysom ​​fraktioner sidstnævnte metode vil sandsynligvis ikke at fange ændringer i translatome der er forårsaget af mRNA&#39;er at overgangen fra let til svær polysomer, mens overvurdere bidraget fra dem, der flytter fra mRNP fraktion til tunge polysomer. Den biologiske betydning af disse uoverensstemmelser mellem de førnævnte metoder understreges af en stor mængde data, der viser, at translationel aktivering af en delmængde af mRNA&#39;er, såsom dem, der er eIF4E-følsomme, overgangen fra lys til tunge polysomer, mens andre, såsom dem, der huser 5&#39;TOP elementer, der er rekrutteret til tunge polysomer direkte fra puljer af ribosom-fri mRNA 6. Interessant nok har mTOR blevet vist, at samtidig modulere oversættelse af &quot;eIF4E-følsomme&quot; og 5&#39;TOP mRNA&#39;er 11.. Derfor kan metodologiske forskelle, der er diskuteret ovenfor forklare den tilsyneladende uoverensstemmelse af konklusionen mellem undersøgelser ved hjælp af ribosom profilering 38,39 og polysom ​​fraktionering 24 til at vurdere virkningerne af mTOR hæmning på translatome. Afslutningsvis polysom ​​fraktionering og ribosom profilering er komplementære metoder, der primært giver oplysninger om antallet af ribosomer associeret med mRNA og placering af ribosomet på mRNA, hhv. Vigtigere er det, trods de mangler og fordele ved disse metoder, er det stadig vigtigt, at de data, genom-dækkende opnået ved begge procedurer er tilstrækkeligt analyseret og funktionelt og biokemisk valideret.

De regulatoriske netværk der styrer genekspression er blevet grundigt undersøgt i de seneste to årtier. Langt størstedelen af ​​disse forskningsindsats med fokus på transkriptionel regulering, hvorved ændringer i steady state mRNA niveauer på en genom-dækkende skala blev anvendt til at bestemme såkaldte &quot;genekspression&quot; profiler. Nylige undersøgelser viser, at steady-state mRNA niveauer kun løst svare til sammensætningen af proteom 1,2, hvilket indikerer, at de posttranskriptionel mekanismer, herunder mRNA oversættelse, spiller en stor rolle i regulering af genekspression 3,4. Faktisk er det blevet anslået, at ~ 50% af protein niveauer fastsættes på niveauet af mRNA oversættelse udødeliggjorte musefibroblaster 5. mRNA oversættelse er et stærkt reguleret proces, hvor mRNAer omsættes til proteiner via orkestreret handling af ribosomer, transfer RNA (tRNA&#39;er) og tilbehør faktorer commonly kaldet oversættelse faktorer (TFS) 6. Proteinsyntese er den mest energikrævende proces i pattedyrceller 7 og derfor globale mRNA oversættelse satser reguleres til at rumme næringsstof tilgængelighed og celleproliferation satser 8. Ud over ændringer i den globale mRNA oversættelse satser, forskellige ekstracellulære stimuli (fx hormoner og vækstfaktorer), intracellulære signaler (f.eks aminosyre niveauer) og forskellige former for stress (f.eks ER-stress) inducerer selektive ændringer i puljer af mRNA&#39;er, der er at blive oversat (translatome) 6. Afhængigt af typen af stimulus oversættelse aktivitet af nogle, men ikke alle mRNA&#39;er dramatisk påvirket, hvilket resulterer i ændringer i proteomet, der kræves til at montere en hurtig cellulært respons 6. Disse kvalitative og kvantitative ændringer i translatome menes at være medieret af samspillet mellem trans-virkende faktorer (fx </em&gt; komponenter af translationel maskiner, hjælpepersonale faktorer eller miRNA), og cis-elementer (RNA elementer eller funktioner) til stede i udvalgte delmængder af mRNAer 6,9. For eksempel ændringer i niveauerne og / eller aktiviteten af hastighedsbegrænsende translationsinitiation faktorer eIF4E og eIF2 modulere selektivt oversættelse af udskrifter er baseret på de specifikke 5&#39;UTR har 6. eIF4E og eIF2 er nødvendige for ansættelsen af mRNA og initiativtager tRNA til ribosomet, henholdsvis 6. En stigning i eIF4E aktivitet selektivt styrker oversættelse af mRNAs huser lange og meget strukturerede 5&#39;UTRs herunder kodning spredning og overlevelse stimulerende proteiner, herunder cykliner, c-myc og Bcl-xL 10. Til gengæld inaktivering af eIF2 fører til en global proteinsyntese standsning, mens selektivt opregulering af translation af mRNA&#39;er, der indeholder korte inhibitoriske opstrøms åbne læserammer (uORFs) i deres 5&#39;UTRs, såsom dem, der koder for store transcriptional regulatorer af det udfoldede protein respons (fx ATF4). Som reaktion på forskellige stimuli, herunder næringsstoffer, vækstfaktorer og hormoner, det mekanistiske / pattedyr målet på rapamycin (mTOR) pathway stimulerer eIF4E aktivitet ved at inaktivere 4E-bindende protein (4E-BP) familie oversættelse undertrykkere, mens MAPK vejen direkte phosphorylates eIF4E 6,11. Til gengæld eIF2α kinaser (dvs. PERK, PKR, HRI og GCN2) hæmmer eIF2 ved phosphorylering sin eIF2α regulatorisk underenhed som respons på næringsstof afsavn, ER-stress og virus infektion 6,12. Ændringer i aktivitet og / eller udtryk for TFs, har andre dele af translationel maskiner og lovgivningsmæssige faktorer, herunder miRNA blevet observeret i forskellige patologiske tilstande, herunder kræft, metaboliske syndromer, neurologiske og psykiatriske lidelser, og nyre-og hjertekarsygdomme 13-19. Kollektivt indikerer disse data, at translationel migchanisms spiller en central rolle i at opretholde cellehomeostase og at deres ophævelsen spiller en central rolle i ætiologien af ​​forskellige sygdomme hos mennesker. Heri er en protokol til fraktionering af polysomer ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering i pattedyrceller, som bruges til at adskille polysomer fra monosomer, ribosomale subunits og messenger ribonucleoprotein partikler (mRNPs) beskrevet. Dette muliggør forskelsbehandling effektivt oversat (forbundet med tunge polysomer) fra dårligt oversat (associeret med lys polysomer) mRNA&#39;er. I dette assay er ribosomer immobiliseret på mRNA under anvendelse oversættelse forlængelses-inhibitorer, såsom cycloheximid 20 og cytosoliske ekstrakter separeret på 5-50% lineære saccharosedensitetsgradienter ved ultracentrifugering. Efterfølgende fraktionering af saccharosegradienter tillader isolering af mRNA&#39;er i forhold til antallet af ribosomer, de binder til. RNA ekstraheret fra hver fraktion kan derefter anvendes til at bestemmeændringer i fordelingen af ​​mRNA&#39;er over gradienten mellem forskellige betingelser, hvorved effektiviteten øges fra toppen til bunden af ​​gradienten translationelle. Northern blotting eller kvantitativ revers transkription-polymerase-kædereaktion (QRT-PCR) anvendes til at bestemme niveauer af mRNA&#39;er i hver fraktion. Alternativt fraktioner, der indeholder tunge polysomer (typisk mere end 3 ribosomer) sammenlægges og genom-dækkende polysom-associerede mRNA niveauer bestemmes ved hjælp af microarray eller dyb-sekventering. Det er af yderste vigtighed at understrege, at niveauerne af polysom-associerede mRNAs er, foruden oversættelse påvirket af transskriptionelle og posttranskriptionel mekanismer, der påvirker cytosoliske mRNA&#39;er niveauer 21. Derfor, for at bestemme forskelle i oversættelse ved hjælp af genom-dækkende data fra polysom-associerede mRNA er det nødvendigt at korrigere for effekterne fra trin i genekspression vej, der er opstrøms for oversættelsetion 21. At tillade en sådan korrektion, er cytosole RNA udarbejdes parallelt med polysom-associeret RNA fra hver prøve, og genom-dækkende steady-state mRNA niveauer bestemmes 21. I øjeblikket er de såkaldte &quot;oversættelse-effektivitet&quot; (TE) score (dvs. log-forholdet mellem polysom-associerede mRNA data og cytosol mRNA data) er ofte ansat til at korrigere for effekterne af ændringer i cytosol mRNA niveauer på oversættelse effektiviteten af en givet mRNA 22.. Men ved hjælp af TE scorer til at identificere forskellen oversættelse er forbundet med betydelige antal falsk positive og falsk negative resultater på grund af en matematisk egenskab af TE-scorer almindeligvis omtales som falsk korrelation 27. Faktisk en undersøgelse af datasæt fra flere laboratorier viste, at sådanne falske korrelationer synes at være uundgåelig, når man analyserer ændringer i translatomes 23. Det fik udvikling af &quot;analyse af differentieret tr<html> anslation &quot;(anota) algoritme, som ikke lider af de nævnte mangler 23. Under anota-analyse en regressionsmodel anvendes til at udlede mål for translationel aktivitet uafhængig af cytosole RNA-niveauer. Sådanne foranstaltninger sammenlignes dernæst mellem vilkår og en statistik beregnes. Brugeren har mulighed for at anvende en varians krympning metode, der forbedrer den statistiske effekt og reducerer forekomsten af falske positive fund i undersøgelser med få gentagelser 24. Signifikant, blev det for nylig påvist, at forstyrrelser i translatome fanget af anota, men ikke TE score korrelerer med ændringer i proteomet 25. Derfor er det stærkt anbefales at anvende anota analyse til identifikation af ændringer i oversættelse på en genom-plan. Mens den teoretiske fundament for anota algoritmen blev drøftet indgående tidligere 21,23,26, her er fokus på, hvordan man anvender det i praksis. ve_content &quot;&gt; Ud over at studere ændringer i mRNA translation aktivitet i cellen, kan det ribosom fraktionering protokol bruges til at isolere og biokemisk og funktionelt karakterisere ribosom-og polysom-associeret protein-komplekser. har denne fremgangsmåde med succes været indsat i fortiden for at identificere komplekser, der regulerer stabiliteten af nyligt syntetiserede polypeptider 27 og / eller er involveret i phosphorylering af komponenter af den translationelle maskineri. Denne anvendelse af polysom ​​fraktioneringsmetode vil også blive kort beskrevet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

mRNA oversættelse spiller en central rolle i reguleringen af ​​genekspression og repræsenterer den mest energikrævende proces i pattedyrceller. Følgelig dysregulering af mRNA-translation anses for at spille en vigtig rolle i en række patologiske tilstande, herunder cancer. Ribosomer også vært chaperones, som letter foldning af spirende polypeptider, hvorved modulerende funktion og stabilitet af nyligt syntetiserede polypeptider. Desuden nye data viser, at ribosomer tjene som en platform for et repertoire af signalmolekyler, som er impliceret i en række post-translationelle modifikationer af nyligt syntetiserede polypeptider, som de fremgår af ribosomet, og / eller komponenter translationel maskiner. Heri er en veletableret metode til ribosomet fraktionering hjælp saccharosedensitetsgradientcentrifugering beskrevet. I forbindelse med egenudviklede &quot;anota&quot; algoritme denne metode giver mulighed for direkte bestemmelse af forskelrential oversættelse af individuelle mRNAs på en genom-plan. Desuden kan denne alsidige protokol anvendes til en række biokemiske undersøgelser med henblik at dissekere funktionen af ​​ribosom-associeret protein-komplekser, herunder dem, der spiller en central rolle i foldning og nedbrydning af nyligt syntetiserede polypeptider.

mTOR er en stor knude på det trådløse netværk, der koordinerer den globale proteinsyntese satser med næringsstof tilgængelighed 19. mRNA oversættelse reguleres hovedsagelig ved initiering trin det hastighedsbegrænsende 6. Andelen af ribosomer engageret i polysomerne positivt korreleret med oversættelse ammefrekvensen 28. Et eksempel på anvendelse af polysom ​​fraktionering metode til at undersøge den rolle, mTOR signalering i mediering af virkningen af ​​insulin på mRNA-translation er præsenteret. Til dette formål blev MCF7 humane brystcancerceller holdes i lavt serum og derefter stimuleret med insulin alene eller i kombination med aktiv-site mTOR inhibitor Torin1. Ikke-stimulerede celler, som blev kontinuerligt holdes i lavt serum, tjente som kontrol. mRNPs, monosome (80S) og polysom ​​fraktioner blev separeret under anvendelse af polysom ​​fraktioneringsmetode. I forhold til kontrol cellerne, insulin inducerede en stigning i absorbans i gradientfraktioner tilsvarendetil polysomer, ledsaget af en samtidig nedgang i absorbansen i fraktionen monosome (figur 1). Disse resultater viser, at andelen af ​​ribosomer involveret i polysomer er øget i insulinbehandlede sammenlignet med kontrolceller derfor indikerer, at som forventet stimulerer insulin globale translationsinitieringsregioner satser. Torin1 vendt effekterne af insulin på absorbans profiler (Figur 1), og dermed bekræfter resultaterne, at mTOR signalering spiller en stor rolle i formidlingen af virkningerne af insulin på oversættelse maskiner 19. Baseret på en tese, at de uoverensstemmelser i gradient forberedelse ikke kan undgås, er der blevet rejst spørgsmål om reproducerbarhed af de indsamlede data ved hjælp af polysom ​​fraktioneringsmetode 22. Til empirisk teste denne potentielt skadelig emne, cytosol og tunge polysom-associeret RNA (mRNA forbundet med 4 og flere ribosomer) blev isoleret<html> fra MCF7-celler blev behandlet med insulin alene eller insulin i kombination med Torin1 fra 4 uafhængige biologiske replikater (figur 2). Virkningerne af insulin og Torin1 for sammensætningen af ​​cytosol og tunge polysom-associeret mRNA i hver gentagelse blev bestemt på en genom-plan ved hjælp af et microarray tilgang. For at bestemme reproducerbarheden af ​​polysom ​​fraktioneringsmetode hovedbestanddelen analyse (PCA) blev anvendt. En sådan analyse viste, at prøver, der hører til hver betingelse var stramt placeret inden for de to første komponenter, mens de forskellige betingelser var godt adskilt (fig. 2). Disse resultater viser, at polysom ​​fraktionering som beskrevet her er meget reproducerbar og derfor hensigtsmæssigt at undersøge kvantitative og kvalitative ændringer i oversættelse på en genom-plan. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Polysomalt profiler viser effekten af serum sult, insulin og mTOR signalering på global oversættelse i MCF7-celler. MCF7-celler blev frataget næringsstoffer (opretholdt i 0,1% FBS) i 16 timer og behandlet med 5 nM insulin (Ins) alene eller i kombination med 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) i 4 timer. Ubehandlede celler, der kontinuerligt frataget næringsstoffer (0,1% FBS) blev anvendt som en kontrol. De tilsvarende cytosoliske ekstrakter blev sedimenteret ved centrifugering på 5-50% saccharosegradienter. Free ribosomale subunits (40S og 60S), monosomer (80S) og antallet af ribosomer i polysom ​​fraktioner er angivet. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Figur 2.. Genom-dækkende data opnået ved hjælp af polysome profilering er meget reproducerbar. MCF7-celler blev behandlet som i fig. 1. cytosoliske og polysom-associerede RNA (&gt; 3 ribosomer) blev ekstraheret fra 4 uafhængige biologiske replikater og deres genom-dækkende mRNA-niveauer blev bestemt ved anvendelse GeneTitan arrays (Affymetrix). PCA blev anvendt til at vurdere reproducerbarheden af ​​de resulterende data. Vist er de første to PCA komponenter til alle behandlinger (T1 = Torin 1, ctrl = kontrol Ins = insulin), oprindelse af RNA (C = cytosol, P = polysom-associeret) og replikater. Prøver fra samme stand og RNA oprindelse er tæt placeret indikerer høj reproducerbarhed.

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Ribosomer spiller en central rolle i proteinsyntesen. Polyribosome (polysom) fraktionering af saccharosedensitetsgradientcentrifugering giver mulighed for direkte bestemmelse af oversættelse effektiviteten af ​​individuelle mRNAer på en genom-plan. Desuden kan denne metode anvendes til biokemisk analyse af ribosom-og polysom-associerede faktorer såsom chaperoner og signalstoffer.

Polysomprofiler Fraktionering og analyse af pattedyr Translatomes på en genom-plan

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Scale-Up fra pattedyr Cell Kultur bruge et nyt lag Lommelærke

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse af Cell Cycle Position i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesian Change-point Algoritme for genom-dækkende analyse af Diverse ChIPseq Datatyper

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Analyse af translationsinitieringskodon under stress betingelser ved Polysomprofiler Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...