Name: polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי המכון הקנדי למענק מחקר הבריאות (CIHR MOP-115,195) וFRQ-S ל-IT, שהוא גם נמען CIHR פרס חוקר צעיר של; והמועצה למחקר השבדי והאגודה למלחמה בסרטן השבדית לOL

<ol>
	<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes:+a+systems+biology+view.">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li><li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells.">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases.">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li><li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways.">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation.">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li><li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease.">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer:+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways.">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li><li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease.">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li><li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+neurodegeneration:+role+and+impact.">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li><li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease.">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments.">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li><li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells.">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li><li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1.">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li><li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide.">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li><li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome.">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li><li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+translational+control+in+CD4++T+cell+subsets.">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13 (2013).</li><li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis.">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li><li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins.">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li><li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

מאמר זה מתאר פרוטוקול חלוקה polysome מבוסס היטב ואחריו שיטת ניתוח שפותח בבית עבור לכידת שינויים איכותיים וכמותיים בפעילות translational בקנה מידת הגנום בתאי יונקים. לסיום מוצלח של תשומת לב מיוחדת בפרוטוקול זה צריך להיות משולם על 1 confluency הנייד) (כשיעורי תפוצה וזמינות חומרי הזנה לתאם עם פעילות תרגום mRNA והוא יכולים להשפיע על הרכב translatome, confluency התא צריך להיות עקבי בחזרות ותנאי ניסוי), 2) תמוגה תא מהירה (על אף נוכחותם של cycloheximide ומעכבי RNAse במאגרים, תמוגה צריכה להיות מהירה ותמציות סלולריות צריכה להיות מעולף על הדרגתיים סוכרוז מייד לאחר תמוגה כדי למנוע השפלה RNA וניתוק של polysomes), 3) הכנת צבע (על מנת להבטיח שחזור נתונים גבוה, צריך להיות מוכן הדרגתיים סוכרוז באמצעות יצרנית השיפוע וspeיש להקפיד cial בעת הטיפול בהם). בנוסף לומד את השינויים בפעילות translational, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבודד מתחמים הקשורים חלבון הריבוזום ולבסס פונקציות הפיזיולוגיות שלהם. לשם כך, ניתן לקבוע רמות ומעמד זירחון של חלבונים הקשורים הריבוזום השונים על ידי המשקעים TCA, ואחריו מערבי סופג, ואילו ניתן immunoprecipitated משברי שיפוע קומפלקסי חלבוני הריבוזום הקשורים ונותחו על ידי מערבי סופג או ספקטרומטר מסה. חסרון של שיטה זו הוא ששיטת שבריר השיפוע האיטית עלולה לגרום לניתוק של חלבונים אפילו קשורים בחוזקה קינטיקה שהכריכה הן בשיתוף / ניתוק מהיר. גורמים הקשורים לפוליפפטידים מסונתזים חדש הם דוגמאות טיפוסיות. פוליפפטידים מסונתזים חדש מתפתחים בצורת הריבוזומים יכולים להיות משותקים בקומפלקסי חלבונים הקשורים הריבוזומים באמצעות linkers הצולבת הכימית כגון 3, 3&#39;-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) ביום 31. גישה זו עולה כי קולטן לקינאז C 1 (RACK1) הופעל קינאז N-המסוף / ג יוני / גורם התארכות תרגום אוקריוטים (JNK) 1A2 מורכב (eEF1A2) מסדיר השפלה של פוליפפטידים מסונתזים חדש בתגובה ללחץ 27. בנוסף, במתודולוגיה דומה במחקרים המראים כי חלבון קינאז C bII (PKCbII) מגויס לריבוזומים ידי RACK1 32 והפעלה של mTOR מורכב 2 (mTORC2) מתרחש על הריבוזומים שבו phosphorylates פוליפפטידים AKT מסונתזים חדש ומווסתים אותם יציבות 33,34. מגבלות עיקריות של שיטת חלוקה polysome אחרי ניתוח anota הן: 1) דרישה למספר גבוה יחסית של תאים (~ 15 x 10 6 תאים), 2) חוסר מידע positional לגבי לוקליזציה של הריבוזום על מולקולת mRNA נתון, ו3 סוגיות) הקשורים להטרו התאי והמולקולריgeneity של רקמות נורמליות וסרטניות. נושאים הקשורים למספר תא הדרוש ניתן לפתור על ידי יישור פסגות ספקטרום ספיגת המתאימים monosomes (80S) של תאים שסכומי הגבלה עם אלו המתקבלות מהתאים גבוה שפע (למשל תאי הלה) 35. טכניקת אפיון ריבוזום (ראה להלן) ניתן להשתמש כדי לקבוע את מיקום של הריבוזום על מולקולת mRNA נתון מדויק, ואילו נושאים הקשורים לתופעות של בלבול של הטרוגניות רקמה על הפרשנות של שינויים בביטוי הגנים המתקבלים ממערכות מורכבות כגון רקמות אדם נדונים בפירוט בפרסום על ידי כרישה וסטורה 36. לאחרונה, הריבוזום רומן פרופיל טכניקה פותח, שבו שברי הריבוזום מוגנים (RPFs) מופקים על ידי RNAse טיפול ונותחו על ידי עמוק רצף 22. טכניקה זו מאפשרת קביעת מיקום הריבוזום ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה, ובכך לספק עד כה unprתובנות ecedented לביולוגית הריבוזום. לדוגמא, פרופיל הריבוזום יכול לשמש לקביעת צפיפות הריבוזום על מולקולת mRNA נתון או זיהוי של אלמנטים ששיעורי התחלת תרגום השפעה כגון אתרים חלופי ייזום, חניכה בקודונים שאינם, אוגוסט ואלמנטים רגולטוריים כמו uORFs. עם זאת, ישנן מספר מגבלות מתודולוגיות המגבילות את יכולתם של פרופיל הריבוזום להעריך את יעילות תרגום ה-mRNA בצורה מדויקת. אלה כוללים הטיות עצמאיות הוצגו על ידי פיצול אקראי וRNAse אני עיכול, הטיות שהוצגו על ידי מעכבי תרגום (למשל התארכות מעכבים כגון emetine וcycloheximide עשויים לגרום להצטברות הריבוזום באתרי חניכה תרגום), מספר רב של תוצאות שליליות חיוביות ושקר שקר קשור עם ציוני TE, כמו גם חוסר הדיוק שלהם בחיזוי קורא שמקורן mRNAs קידוד חלבון 37. ואולי הכי חשוב, ואילופרופיל הריבוזום מאפשר זיהוי ישיר של עמדה הריבוזום על מולקולת mRNA נתון, מספר הריבוזומים המשויך mRNA נתון מוערך בעקיפין על ידי נרמול תדרים שלה כתוב בRPFs (mRNA הקשורים הריבוזום) על פני אלו שנצפו בmRNAs באופן אקראי המקוטע (סה&quot;כ mRNA). לדוגמא, בהגדרה פשוטה שבו ארבע מולקולות &quot;B&quot; mRNA (Ba, Bb, BC ו BD) תפוסות על ידי ארבעה הריבוזומים בעמדות 1, 2, 3 ו -4, חסרון הגלום בטכניקת פרופיל הריבוזום לא יתיר הבחנה בין תרחיש שבו כל 4 הריבוזומים לשייך רק עם ה-mRNA Ba בעמדות 1, 2, 3, ו -4 ותרחיש שבו Ba, Bb, BC ו-BD-mRNA כל אחד מהם נכבשו על ידי הריבוזום בודד בעמדה 1, 2 , 3, ו -4, בהתאמה. לעומת זאת, במהלך חלוקה polysome, polysome יושרה נשמרה, ובכך לאפשר בידוד של בריכות של mRNAs קשור למספר מוגדר של הריבוזומים (איור 1). יבוא זההבחנה בין נמלת חלוקה polysome ופרופיל הריבוזום עולה כי בעוד שהשיטה לשעבר יכולה לשמש כדי להשוות ישירות mRNAs בmRNP, שברי אור וpolysome הכבד, השיטה השנייה צפויה להיכשל כדי ללכוד שינויים בtranslatome שנגרמים על ידי mRNAs שהמעבר מ להדליק לpolysomes הכבד, תוך הערכת יתר התרומה של אלה שעוברים מחלק mRNP לpolysomes הכבד. המשמעות הביולוגית של הבדלים אלה בין השיטות הנ&quot;ל מודגשת על ידי גוף גדול של נתונים המראה כי הפעלת translational של קבוצת משנה של mRNAs כמו אלה שהם eIF4E רגיש, מעבר מהאור לpolysomes כבד, ואילו כגון אלה, אחרים מחסה אלמנטי 5&#39;TOP, מגויסים לpolysomes הכבד ישירות מבריכות של mRNA ללא הריבוזום 6. מעניין, את מסלול mTOR הוכח לווסת את התרגום של &quot;eIF4E רגיש&quot; ו5&#39;TOP mRNAs 1 במקביל1. לכן, הבדלים מתודולוגיים שנדונו לעיל יכולים להסביר את חוסר ההתאמה לכאורה של המסקנה בין מחקרים באמצעות הריבוזום פרופיל 38,39 וחלוקת polysome 24 כדי להעריך את ההשפעות של עיכוב mTOR בtranslatome. לסיכום, חלוקה polysome ופרופיל הריבוזום הם שיטות משלימות שמספקות בעיקר מידע לגבי מספר הריבוזומים הקשורים mRNA ואת המיקום של הריבוזום על mRNA, בהתאמה. חשוב מכך, על אף החסרונות ויתרונות של שיטות אלה, הוא נשאר חיוני כי נתוני הגנום מתקבלים על ידי שני ההליכים כראוי ניתחו ותפקודי ויוכימית אומתו.

רשתות הרגולטורים ששולטים בביטוי גנים נחקרו רבות בשני העשורים האחרונים. הרוב המכריע של מאמצי המחקר האלה התמקדו בתקנת תעתיק, לפיה שינויים ברמות ה-mRNA מצב היציב בקנה מידת הגנום שימשו לקביעת פרופילים &quot;ביטוי גנים&quot; מה שנקרא. מחקרים שנעשה לאחרונה עולים כי רמות ה-mRNA מצב יציב רק באופן רופף מתאימות להרכב של proteome 1,2, ובכך מצביעים על כך שהמנגנונים שלאחר התעתיק, כולל תרגום ה-mRNA, לשחק תפקיד מרכזי בויסות של ביטוי גני 3,4. ואכן, זה כבר העריך כי ~ 50% מרמות החלבון נקבעים ברמה של תרגום ה-mRNA בfibroblasts העכבר הנציח 5. תרגום ה-mRNA הוא תהליך מוסדר מאוד שבמהלכו mRNAs מתורגמים לחלבונים באמצעות פעולה מתוזמרת של הריבוזומים, RNAs העברה (tRNAs) ושיתוף גורמי אבזרהמכונה גורמי תרגום (TFS) 6 mmonly. סינתזה של חלבונים היא התהליך הגוזל האנרגיה ביותר בתאי יונקים 7 ולכן שיעורי תרגום mRNA הגלובליים מותאמים כדי להתאים לזמינות חומרי מזון ושיעורי התפשטות תאי 8. בנוסף לשינויים בשערי הגלובליים תרגום ה-mRNA, גירויים שונים תאיים (למשל הורמונים וגורמי גדילה), רמזים תאיים (רמות חומצת אמינו למשל) וסוגים שונים של לחץ (למשל ER-מתח) לגרום לשינויים סלקטיבית בבריכות של mRNAs ה מתורגם (translatome) 6. בהתאם לסוג של גירוי, פעילות תרגום של חלק, אבל לא כל mRNAs מושפעים באופן דרמטי, ובכך וכתוצאה משינויים בproteome הנדרשים לעלות תגובה תאית מהירה 6. שינויים איכותיים וכמותיים אלו בtranslatome הם חשבו להיות מתווכים על ידי יחסי הגומלין בין גורמי טרנס משחק (לדוגמא: </em&gt; רכיבים של מכונות translational, גורמי עזר או miRNAs) וcis-אלמנטים (יסודות RNA או תכונות) קיימים בתת נבחרת של mRNAs 6,9. לדוגמא, שינויים ברמות ו / או בפעילות של ייזום תרגום שער הגבלת גורמי eIF4E וeIF2 סלקטיבי לווסת את התרגום של תמלילים המבוססים על תכונות 5&#39;UTR הספציפיות 6. eIF4E וeIF2 נדרשים לגיוס של mRNA והיוזם tRNA לריבוזום, בהתאמה 6. גידול בפעילות באופן סלקטיבי eIF4E מחזק תרגום של mRNAs מחסה 5&#39;UTRs הארוך ומובנה מאוד כולל אלו התפשטות קידוד והישרדות גירוי חלבונים כוללים cyclins, c-myc וBcl-XL 10. בתורו, איון של eIF2 מוביל לכיבוי סינתזת חלבון עולמי, בעוד באופן סלקטיבי את ויסות תרגום של mRNAs המכיל מסגרות קצרות מעכבות במעלה הזרם קריאה פתוחה (uORFs) ב5&#39;UTRs, כמו t קידוד ההורים אלהרגולטורים ranscriptional של תגובת פרש החלבון (לדוגמא ATF4). בתגובה לגירויים שונים, כולל חומרים מזינים, גורמי גדילה והורמונים, יעד מכניסטית / יונקי מסלול rapamycin (mTOR) ממריץ את פעילות eIF4E ידי inactivating חלבון 4E מחייבת משפחה (4E-BP) של מדכאי תרגום, ואילו מסלול MAPK ישירות phosphorylates eIF4E 6,11. בתורו, קינאזות eIF2α (כלומר הטבה, PKR, HRI וGCN2) לעכב eIF2 ידי phosphorylating מקטע הרגולציה eIF2α בתגובה למחסור באבות מזון, ER-מתח וזיהום בנגיף 6,12. שינויים בפעילות ו / או הביטוי של TFS, רכיבים אחרים של מכונות translational וגורמי רגולציה כוללים miRNAs נצפו במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן, תסמונות המטבולית, הפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות, ומחלות כליות ולב וכלי דם 13-19. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על כך שTranslationalchanisms לשחק תפקיד מרכזי בשמירה על הומיאוסטאזיס וכי ביטולם משחק תפקיד מרכזי באטיולוגיה של מחלות אנושיות שונות. בזאת, פרוטוקול לחלוקה של polysomes ידי צנטריפוגה סוכרוז צפיפות שיפוע בתאי יונקים, המשמשת להפרדת polysomes מmonosomes, יחידות משנה ריבוזומלי וחלקיקי ribonucleoprotein השליח (mRNPs) הוא תאר. זה מאפשר אפליה בין תורגם ביעילות (הקשורים polysomes כבד) מmRNAs תורגם בצורה גרועה (הקשורים polysomes אור). ב assay זה, הריבוזומים הם משותקים על ה-mRNA באמצעות מעכבי התארכות תרגום כגון cycloheximide 20 ותמציות cytosolic מופרדות על הדרגות צפיפות סוכרוז ליניארי 5-50% על ידי ultracentrifugation. חלוקה הבאה של הדרגתיים סוכרוז מאפשרת בידוד של mRNAs לפי מספר הריבוזומים הם נקשרים אליו. RNA המופק מכל חלק ניתן לאחר מכן נעשה שימוש כדי לקבועשינויים בהפצות של mRNAs מעבר ההדרגתי בין מצבים שונים, לפיה עליות יעילות translational מהחלק העליון לחלק התחתון של השיפוע. הצפון סופג או תגובת שרשרת כמותית שעתוק לאחור פולימרז (qRT-PCR) משמשות כדי לקבוע רמות של mRNAs בכל חלק. לחלופין, ברים המכילים polysomes הכבד (יותר מ -3 הריבוזומים בדרך כלל) הם אספו ורמות ה-mRNA הקשורים polysome הגנום נקבעות באמצעות microarray או עמוק רצף. זה הוא בעל חשיבות עליונה להדגיש כי הרמות של mRNAs הקשורים polysome הן, בנוסף לתרגום, שנפגעו על ידי מנגנוני שעתוק ולאחר תעתיק המשפיעים על רמות mRNAs cytosolic 21. לכן, כדי לקבוע את ההבדלים בתרגום באמצעות נתוני הגנום מmRNA הקשורים polysome יש צורך לתקן את ההשפעות משלבים במסלול ביטוי גנים שנמצאות במעלה הזרם של תרגומיםtion 21. כדי לאפשר תיקון כזה, RNA cytosolic מוכן במקביל עם RNA הקשורים polysome מכל מדגם ורמות ה-mRNA מצב יציב הגנום נקבעים 21. נכון לעכשיו, מה שנקרא &quot;תרגום יעיל&quot; ציונים (TE) (כלומר לוג היחס בין נתוני ה-mRNA הקשורים polysome ונתונים mRNA cytosolic) לעתים קרובות עובד כדי לתקן את ההשפעות של שינויים ברמות ה-mRNA cytosolic על יעילות תרגום של ניתנו mRNA 22. עם זאת, שימוש בציוני TE לזהות תרגום ההפרש קשור למספרים משמעותיים של ממצאים שליליים חיוביים ושקר שקר בשל רכוש מתמטי של ציוני TE מכונה מתאם מזויף כ27. ואכן סקר של ערכות נתונים ממעבדות רבות מצביע על כך שנראה מתאמים מלאכותיים כל כך להיות בלתי נמנע בעת ניתוח שינויים בtranslatomes 23. זה מתבקש פיתוח של &quot;הניתוח של TR ההפרש<html> אלגוריתם anslation &quot;(anota), שאינו סובל מהליקויים האמורים 23. במהלך anota-ניתוח מודל רגרסיה המשמש לחישוב מדדים של פעילות translational בלתי תלויים ברמות RNA cytosolic. אמצעים אלה הושוו בין התנאים ונתונים סטטיסטיים מחושבים. למשתמש יש את האפשרות של החלת שיטת הצטמקות שונות, אשר משפרת את הכוח סטטיסטי ומפחיתה את התרחשותם של ממצאים חיוביים כוזבים במחקרים עם כמה חזרות 24. באופן משמעותי, זה היה הוכיח לאחרונה כי הפרעות בtranslatome שנתפסו על ידי anota, אבל ציונים לא TE, לתאם עם שינויים בproteome 25. לכן, מומלץ מאוד ליישם את ניתוח anota לזיהוי שינויים בתרגום בקנה מידת הגנום כולו. בעוד היסודות התיאורטיים של אלגוריתם anota נדונו בפירוט בעבר 21,23,26, כאן דגש הוא על איך ליישם אותו הלכה למעשה. ve_content &quot;&gt; בנוסף ללימוד שינויים בפעילות תרגום mRNA בתא, פרוטוקול חלוקה הריבוזום זה יכול לשמש כדי לבודד וביוכימית ותפקודית מאפיין את הריבוזומים ולמתחמים הקשורים החלבון polysome. גישה זו בהצלחה נפרסה בעבר לזהות מתחמים המסדירים את היציבות של פוליפפטידים מסונתזים חדש 27 ו / או מעורבים בזירחון של רכיבים של מכונות translational. זה יישום של שיטת חלוקה polysome יהיה גם דנו בקצרה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

תרגום mRNA משחק תפקיד מרכזי בוויסות של ביטוי גנים, ומייצג את תהליך האנרגיה הרב ביותר בתאי יונקים. בהתאם לכך, חוסר ויסות של תרגום ה-mRNA נחשבת לשחק תפקיד מרכזי במגוון רחב של מצבים פתולוגיים כוללים סרטן. הריבוזומים גם לארח מלווים, המאפשרים קיפול של פוליפפטידים המתהווים, ובכך ויסות תפקוד ויציבות של פוליפפטידים מסונתזים חדש. בנוסף, הנתונים מצביעים על כך שמתעוררים הריבוזומים ישמשו כפלטפורמה לרפרטואר של מולקולות איתות, שהם מעורבים במגוון רחב של שלאחר translational שינויים של פוליפפטידים מסונתזים חדש כפי שהן עולות מהריבוזום, ו / או רכיבים של מכונות translational. בזאת, שיטה מבוססת היטב של חלוקה הריבוזום באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מתוארת. בשילוב עם האלגוריתם בבית פיתח &quot;anota&quot; שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של diffeתרגום rential של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. יתר על כן, פרוטוקול זה צדדי יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים ביוכימיים במטרה לנתח את הפונקציה של מתחמים הקשורים חלבון הריבוזום, כולל אלו שמשחקים תפקיד מרכזי בקיפול והשפלה של פוליפפטידים מסונתזים חדש.

mTOR הוא צומת מרכזית של הרשת הסלולרית, המרכזת את שיעורי סינתזת חלבון העולמיים עם זמינות חומרי הזנה 19. תרגום mRNA מוסדר בעיקר בשלב ייזום שער הגבלת 6. חלקם של הריבוזומים העוסקים בpolysomes חיובי בקורלציה עם שיעורי חניכה תרגום 28. דוגמא ליישום שיטת חלוקה polysome כדי לחקור את התפקיד של איתות mTOR בתיווך ההשפעות של אינסולין על תרגום ה-mRNA מוצגת. לשם כך, תאי סרטן השד אנושיים MCF7 נשמרו בסרום נמוך ולאחר מכן מגורה עם אינסולין לבד או בשילוב עם מעכב mTOR הפעיל באתר Torin1. תאים שאינו מגורה שהוחזקו ברציפות בסרום נמוך, שימשו כבקרה. mRNPs, monosome (80S) והשברים polysome הופרדו בשיטת חלוקה polysome. יחסית לתאי בקרה, אינסולין הנגרם עלייה בספיגה בשברי שיפוע המתאיםלpolysomes, לוו בירידה מקבילה בספיגה בשבריר monosome (איור 1). ממצאים אלה מראים כי חלקם של הריבוזומים העוסקים בpolysomes מוגבר באינסולין שטופל בהשוואה לתאי בקרה, ולכן מצביע על כך, כצפוי, אינסולין מגרה שיעורי התחלת התרגום עולמיים. Torin1 התהפך ההשפעות של אינסולין על פרופילים ספיגת (איור 1), ובכך מאמת את הממצאים שאיתות mTOR משחקת תפקיד מרכזי בתיווך ההשפעות של אינסולין על מכונות תרגום 19. בהתבסס על עיקרון שלא ניתן להימנע מחוסר העקביות בהכנה הדרגתית, שאלות הועלו לגבי שחזור של נתונים המתקבלים בשיטת חלוקה polysome 22. כדי לבדוק סוגיה זו עלולה להיות מזיקה, cytosolic ו-RNA הכבד הקשורים polysome (mRNA הקשורים 4 ויותר הריבוזומים) באופן אמפירי היו מבודדים<html> מMCF7 תאים שטופלו באינסולין לבד או אינסולין בשילוב עם Torin1 מ4 משכפל ביולוגי עצמאי (איור 2). ההשפעות של אינסולין וTorin1 על הרכב cytosolic וmRNA הקשורים polysome הכבד בכל אחד לשכפל נקבעו בקנה מידת הגנום באמצעות גישת microarray. כדי לקבוע את שחזור של שיטת חלוקה polysome הניתוח העיקרי הרכיב (PCA) יושם. ניתוח כזה הראה כי הדגימות שייכות לכל תנאי הוצבו בחוזקה בשני המרכיבים הראשונים בזמן שהתנאים השונים הופרדו (איור 2) כן. ממצאים אלה מראים כי שיטת חלוקה polysome כפי שמתואר כאן היא מאוד לשחזור, ולכן מתאים ללמוד שינויים כמותיים ואיכותיים בתרגום ברמה הגנום כולו. &quot;Src =&quot; ad/51455/51455fig1highres.jpg / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. פרופילי Polysomal מראים את ההשפעות של רעב בסרום, אינסולין וmTOR איתות על תרגום העולמי בתאי MCF7. MCF7 תאים נשללו של חומרים מזינים (נשמרו ב0.1% FBS) ל16 שעות וטופלו באינסולין 5 ננומטר (Ins) לבד או בשילוב עם 250 ננומטר Torin1 (Ins + Torin1) למשך 4 שעות. תאים שלא טופלו שנשללו ברציפות של חומרים מזינים (0.1% FBS) שימשו כביקורת. תמציות cytosolic המקבילות היו משקעות על ידי צנטריפוגה במילויי סוכרוז 5-50%. יחידות משנה חינם ריבוזומלי (40S ו60S), monosomes (80S) ומספר הריבוזומים בשברי polysome מצוינים. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> איור 2. נתוני הגנום שהושגו באמצעות polysome פרופיל הוא מאוד לשחזור. טופלו MCF7 תאים כמו באיור 1. Cytosolic ו-RNA הקשורים polysome (&gt; 3 הריבוזומים) היה שחולצו מן 4 משכפל ביולוגי עצמאי ורמות ה-mRNA הגנום שלהם נקבעו באמצעות מערכי GeneTitan (Affymetrix). PCA שימשה כדי להעריך את שחזור של הנתונים מתקבל. מוצגים הם שני המרכיבים הראשונים PCA עבור כל הטיפולים (T1 = טורין 1; ctrl = שליטה; Ins = אינסולין), מקורו של RNA (C = cytosolic, P = הקשורים polysome) ומשכפלים. דוגמאות מאותו המצב ומוצא RNA מוצבות בשיתוף פעולה הדוק המצביעות שחזור גבוה.

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Scale-Up של תרבית תאים היונקים באמצעות Flask multilayered חדש

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

אלגוריתם רומן ייס שינוי נקודות לניתוח הגנום רחב, של סוגי נתוני ChIPseq מגוונים

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...