Name: polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research Grant (CIHR MOP-115195) og FRQ-S til det, som også er en mottaker av CIHR Young Investigator Award; og det svenske Vetenskapsrådet og det svenske Kreftforeningen til OL

En. Sukrosegradient Forberedelse <ol><li> Forbered 100 ml 60% (w / v) sukrose-løsning i DDH 2 O. Løsningen bør filtreres gjennom et 0,22 um filter for å hindre tilstopping av produksjonsrøret under fraksjoneringstrinn (trinn 3.5). </li><li> Forbered 5 ml av 10x sukrosegradient buffer: 200 mM HEPES (pH 7,6), 1 M KCl, 50 mM MgCl 2, 100 pg / ml cykloheksimid, 1x protease inhibitor cocktail (EDTA-fri), 100 enheter / ml RNase-inhibitor. </li><li> Ved hjelp av den 60% oppløsning fremstilt som beskrevet i trinn 1.1, blir 40 ml av 5% og 50% sukrose-løsninger i 1x sukrosegradient buffer. </li><li> Bruk Marker blokk følger med gradient maker å markere halvfull punkt på hver polyallomer ultracentrifugation tube for lagdeling (6 ultra-sentrifuge rør totalt). Bruke lagdeling enhet som følger med gradient maker, tilsett 5% sukroseløsning til den når den halvfulle poeng. Deretter tilsett 50% sukrose-løsning fra bunnen til den interface mellom de to løsninger når halv-full punkt. Spesielle hensyn må tas i løpet av dette trinnet, slik at graderinger er så like som mulig, da dette er avgjørende for å oppnå høy reproduserbarhet (se nedenfor). </li><li> Tett rør med rente sone caps følger med gradient maker og overføre de forseglede rør til røret holderen på gradient maker. </li><li> Kjør gradient trakter for å oppnå en lineær 5% til 50% gradient. 6 lineære gradienter vil bli dannet i løpet av få minutter ved rotasjon i høy helningsvinkel. Merk: sukrose gradienter kan brukes umiddelbart eller lagres ved -80 ° C i 6 måneder. </li></ol> 2. Isolasjon og sedimentasjon av Polysomes <ol><li> Avhengig av celletypen, seede celler i 1-5 15-cm petriskåler (~ 15 x 10 6 celler) i minst en dag før lysis. På dagen for forsøket celler bør være ~ 80% konfluent. <!-- Merk: Optimal sammenflyting er kritisk fordi oversettelse og spredning priser er direkteproporsjonale 8, og derfor polysomes bør analyseres i aktivt prolifererende celler (dvs. omregnings priser vil betydelig nedgang i løpet konfluente celler mens lav confluency av cellene ikke kan gi tilstrekkelig materiale for videre analyse). Unntak fra denne regelen kan gjøres hvis for eksempel eksperimentator er interessert i å studere effekten av kontakt hemming på oversettelse. Men cellene skal ikke holdes under løpet konfluente forhold for lenge, da dette kan ha utilsiktede virkninger på translatome. Ved transfeksjon er nødvendig, de fleste av de kommersielt tilgjengelige systemene ikke påvirke polysome nivåer. Fordi den dagen transfeksjon cellene må være 80-90% konfluent, anbefales det å forplante celler 24 timer etter transfeksjon og isolere polysomes 48 timers post-transfeksjon fra cellene ~ 80% konfluent. </li><li> Inkuber cellene med cykloheksimid ved en endelig konsentrasjon på 100 mikrogram / ml i vekstmedier i 5 min ved 37 ° C og 5% CO 2; og vaske cellene to ganger med 10 ml iskald 1 x PBS inneholdende 100 pg / ml cykloheksimid. Cycloheximide er en oversettelse forlengelse inhibitor som &quot;fryser&quot; ribosomer på mRNA, og dermed hindre ribosom kjøre off 20. </li><li> Skrap celler forsiktig i 5 ml iskald 1 x PBS inneholdende 100 pg / ml cykloheksimid og samle dem i et 50 ml rør. Det er viktig at dette trinnet er utført relativt rask som forlater cellene på is i en lengre tidsperiode vil drastisk redusere kvaliteten på polysome preparatet. </li><li> Samle-celler ved sentrifugering ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C. </li><li> Kast supernatanten og resuspender cellene i 425 pl av hypotonisk buffer [(5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,5 mM MgCl2, 1,5 mM KCl og 1 x protease inhibitor cocktail (EDTA-fri)], tilsett 5 pl av 10 mg / ml CHX, 1 ul av 1 M DTT, 100 enheter av RNAse inhibitoren og virvle i 5 sekunder etterfulgt av tilsetning av 25 ul av 10% Triton X-100 (sluttkonsentrasjon 0,5%) og 25 pl av 10% natriumdeoksycholat (sluttkonsentrasjon 0,5%) og vortex i 5 sek. På grunn av celle svelling, vil hypoton buffer forstyrre plasmamembranen, mens de milde vaskemidler betingelser blir brukt for å oppløse cytosoliske og endoplasmatiske retikulum-assosierte ribosomer, uten å forstyrre den kjernefysiske konvolutten. </li><li> Sentrifuger lysater ved 16.000 xg i 7 min ved 4 ° C og overføring supernatant (~ 500 ul) i et nytt pre-avkjølt 1,5 ml rør. Mål OD ved 260 nm for hver prøve ved anvendelse av et spektrofotometer, og beholde 10% av lysat som input som vil bli brukt til å bestemme cytosoliske steady-state-mRNA nivåer. Fortynne innspill til 750 mL i RNAse fri H 2 O, tilsett 750 mL av Trizol og flash fryse i flytende nitrogen. </li><li> Overfør ultrasentrifugerør rør som inneholder sakkarosegradienter i pre-kjølt rotor bøtter. Fjern 500 mL fra toppen av sakkarosegradienter. Juster lysatene, slik at de inneholder den samme OD (10-20 OD ved 260 nm) i 500 ul lyseringsbuffer (beskrevet i trinn 2.5) og laste dem inn i hver sukrosegradient. Merk: Det er viktig å umiddelbart laste lysates på graderinger, da dette vil kritisk forbedre kvaliteten på polysome forberedelser. </li><li> Vei og balansere hver gradient før ultrasentrifugering. </li><li> Sentrifuger ved 222 228 x g (36 000 rpm), i 2 timer ved 4 ° C ved hjelp av SW41Ti rotor. Merk: For ikke å forstyrre sakkarosegradienter, bør &quot;lav&quot; bremsealternativ velges. </li></ol> Tre. Polysome fraksjonering og RNA Utvinning <ol><li> Forbered fraksjonssamler ved å rense den med varmt RNAse gratis vann som inneholder RNase ZAP (noen spray). Gjenta dette trinnet med varm RNAse gratis vann bare. Slå UV-lampe og vente på grønt lys for å vises. </li><li> Fjern forsiktig rørene fra rotoren og plassere dem på is. Slå på datamaskinen, pumpe, UV-detektor og fraksjonssamler. Sett pumpen på 3 ml / min og fill slangen med chasing løsning [60% (w / v) sukrose inneholdende 0,02% (w / v) bromfenol blå] til den når nålen. Sørg for å se minst én dråpe som kommer ut av nålen, og forsikre seg om at ingen bobler er innført i pumpesprøyte eller slangen. </li><li> Legg 2 ml rør i en fraksjonssamler. Lansere analyseprogram og satt sensitivitet til + / - 10 MeV. Sett &quot;tidsbase&quot; til 100 sek. </li><li> Plasser hvert ultracentrifugation rør inn i UV-detektor samtidig sørge for at røret er i rettvinklet posisjon. Pierce røret med nålen ved å vri knotten under røret holderen. </li><li> Sett pumpen ved 1,5 ml / min, og samle fraksjonene sette tids til 30 sek på fraksjonssamler (dette vil resultere i ~ 750 pl i hver fraksjon). Sett pumpen i &quot;fjernstilling&quot;, starte pumpen og fraksjonssamler, og samtidig starte opptak ved hjelp av DAQ tracer. Dette starter en oppadgående forskyvning av sukrose grasiktsmessig, og en samtidig detektering av UV-absorbans ved 254 nm. Slutte å samle så snart den første dråpe chasing løsningen faller i en 2 ml samle tube. </li><li> Lagre sporing i csv-format og (en gang steg 3,7 er ferdig), i et regnearkprogram, gjør du følgende for å identifisere plasseringen av hver fraksjon i UV absorbans profil.: <ol><li> Merk kolonne inneholdende verdier svarende til absorbans ved 254 nm (kanal 0). </li><li> Lag en jevn linje punktplott av absorbances. </li><li> Sett hovedenheten av X-aksen til 300 (verdi erholdt ved å dividere volumet av 5% -50% sakkarose-gradient (~ 12 ml) ved oppsamlingstiden for hver fraksjon (30 sek). </li></ol></li><li> Til 750 mL av Trizol i hver fraksjon, og flash-fryse-fraksjoner i flytende nitrogen. </li><li> Isoler polysome-forbundet og cytosoliske (fra 2,6) RNA bruker Trizol protokollen i henhold til produsentens instruksjoner. For å øke RNA yield, fortsett med RNA presipitation ved -80 ° C i 30 min og -20 ° C over natten. Merk: Fordi mengden av RNA utfelt fra polysomal fraksjoner ikke kan være godt synlig, anbefales det å legge til transportør. Legg 1 mL av bæreren til røret før RNA utfellingstrinnet under Trizol-protokollen. </li><li> Bestem hvilke fraksjoner tilsvarer mRNA forbundet med&gt; 3 ribosom (ved hjelp tilnærming beskrevet 3,6) og basseng disse fraksjonene. Bruk RNA opprydding kit for å utføre opprydding av samlet polysome-forbundet og cytosoliske RNA (fra 2,6). Sende inn prøver til et anlegg for å avgjøre genome-wide mRNA nivåer ved hjelp av mikromatriser eller dyp-sekvensering. Dersom oversettelse av bestemte mRNAer trenger å bli overvåket ved RT-qPCR, anbefales det å bruke 500 ng av RNA (fra samlede fraksjoner inneholdende&gt; 3 ribosomer eller total RNA) for å syntetisere cDNA. Bemerk: mRNA forbundet med&gt; 3 ribosomer settes vilkårlig for å representere en effektiv oversatte mRNA og inneholder mer enn 80% av nylig syntetisertstore polypeptider 28,29. Inkludert fraksjoner svarende til lys (1-2), medium (2-3) og tunge polysomes (&gt; 3) vil være fordelaktig, men disse vil øke antallet av prøvene med 2 ganger (4 vs 2 per tilstand) og dermed Kostnaden for forsøket. Til tross for at det er forventet at nedgangen i kostnadene for dyp-sekvensering og microarray analyse i fremtiden, bør favorisere den sistnevnte tilnærmingen, er det anbefales at under validering, er fordeling av individuelle mRNA overvåkes i hver fraksjon. </li></ol> 4. Genome-wide Analyse av mRNA Oversettelse <ol><li> Installer R, bioconductor og anota pakken: <ol><li> Installer R (nedlasting fra r-project.org) og starte en R-session. Merk: R er tilgjengelig for alle operativsystemer og anota vil kjøre på dem alle. </li><li> Installer bioconductor (bioconductor.org). R koden tolkes gjennom R-terminal (f.eks R konsollen i Windows - som er lansert av double klikke R snarvei). Bioconductor er installert ved å skrive (i R-terminal): kilde (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite () </li><li> Installer anota bioconductor pakken (og qvalue pakke som anota krever) ved å skrive (i R-terminal): kilde (&quot;http://bioconductor.org/biocLite.R&quot;) biocLite (c (&quot;anota&quot;, &quot;qvalue&quot;)) </li><li> Test at pakken ble installert og åpne anota manualen ved å skrive (i R-terminal): bibliotek (&quot;anota&quot;) vignett (&quot;anota&quot;) </li><li> Merk: Ekstra hjelp for alle funksjoner som er brukt i den anota pakken kan finnes enten på det anota web-side (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html) eller ved å bruke hjelpfunksjonen innen R. For eksempel, for å få hjelp på anotaPerformQc funksjonen gå til R-terminal og type (merk at dette fungerer bare når anota pakken har blitt lastet): bibliotek (&quot;anota&quot;) # laster anota pakke ? AnotaPerformQc # åpner hjelp for denne funksjonen </li></ol></li><li> Importere data til R: <ol><li> Forbered uttrykk data for analyse. Data skal pre-behandlet (f.eks normalisert og kvalitetskontrollert) med hensyn til den teknikk som ble brukt for å måle mRNA-nivåer. Inndataverdiene må logge forvandlet, mest vanlig er log2. Kompilere en tabell med data for alle polysome-forbundet RNA prøver og en for alle cytosoliske RNA prøver. Den første kolonnen skal inneholde genet-identifikatorer etterfulgt av én datakolonne per prøve; den første raden bør inneholde navn på prøvene. Det er viktig at tabellene har identisk prøve rekkefølge og identisk genet orden. Lagre filene som tabulatorinndelte tekstfiler som kalles &quot;myPolysomeData.txt&quot; og &quot;myCytosolicData.txt&quot;. </li><li> I dette eksemplet er to eksempler på klasser benyttes (kontroll eller syke) med 3 replikater per klasse, for derved å generere seks prøver med denne rekkefølge: C1, C2, C3, D1, D2, D3 i både myCytosolicData.txt og myPolysomeData.txt filer. Anota krever minst tre gjentak per tilstand når det er to eksempler klasser. Disse bør være uavhengige biologiske replikater. </li><li> Lag en katalog som inneholder data input-filer (myPolysomeData.txt og myCytosolicData.txt). Åpen R fra denne katalogen. I Windows / Mac kan dette gjøres ved å kopiere en R-snarvei inn i denne katalogen og lanserer R bruker denne snarveien (arbeids direkte kan også endres ved hjelp av rullegardinmenyer). </li><li> Lag en fil som heter myCode.R innenfor den nyopprettede katalogen og åpne den med et tekstredigeringsprogram. Skriv inn koden i denne filen. </li><li> For å laste dataene inn i R skrive følgende kode til myCode.R filen (husk å re-lagre denne filen etter hvert tillegg av kode). Nedenfor er en steg-for-step forklaring av koden, men all kode kan også bli skrevet innledningsvis, og kildefunksjonen (som går koden, se nedenfor) brukt bare en gang: # # Dette laster anota bibliotek bibliotek (anota) # # Dette laster inn data i R dataCyto &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myCytosolicData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, sep = &quot; t&quot;)) dataPoly &lt;- as.matrix (read.table (&quot;myPolysomeData.txt&quot;, header = TRUE, row.names = 1, sep = &quot; t&quot;)) </li><li> Kjør koden i R ved å skrive direkte inn i R terminal: kilde (&quot;myCode.R&quot;) </li><li> Kontroller at dataene ble lastet inn ved å skrive (inn i R-terminal): hode (dataCyto) # vil vise toppen av dataCyto tabellen hode (dataPoly) </li></ol></li><li> Identifisering av forskjellig oversatte gener: <ol><li> Genererer en vektor som beskrivereksempel kategorier (en vektor er en type objekt i R). Denne vektoren bør reflektere prøven orden i myPolysomeData.txt og myCytosolicData.txt, slik at alle de tre objekter har en identisk rekkefølgen av prøvene. Vektoren vil bli brukt når instruere anota om hvilke prøver å sammenligne. Legg til følgende i myCode.R filen: # # Merk at replikere prøvene har identiske prøveklassen # # Beskrivelser (dvs. &quot;C&quot; eller &quot;D&quot;) i denne vektoren. myPhenotypes &lt;- c (&quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;C&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;, &quot;D&quot;) </li><li> Utføre kvalitetskontroll av datasettet. Det finnes en rekke kvalitets tiltak som må vurderes før anota kan anvendes for analyse. Disse beskrives i detalj i anota manualen. Legg denne koden til myCode.R filen og lagre: anotaQcOut &lt;- anotaPerformQc (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly,phenoVec = myPhenotypes) anotaResidOut &lt;- anotaResidOutlierTest (anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Kjør koden ved å skrive inn R-terminal: kilde (&quot;myCode.R&quot;) Dette vil generere en rekke utgangsfiler, som kan undersøkes som beskrevet i anota manualen. </li><li> Identifiser differentially oversatte gener. Prøvene vil bli sammenlignet basert på den alfabetiske rekkefølgen på navnene levert til &quot;phenoVec&quot; parameter (dvs. &quot;myPhenotypes&quot; vektor) med mindre de er angitt av brukeren (ved hjelp av &quot;kontraster&quot; parameter). Legg til følgende kode myCode.R filen og avslutt ved å bruke &quot;source&quot;-kommandoen inne i R-terminal som beskrevet ovenfor: anotaSigOut &lt;- anotaGetSigGenes (dataT = dataCyto, dataP = dataPoly, phenoVec = myPhenotypes, anotaQcObj = anotaQcOut) </li><li> Bruk hjelpen for anotaGetSigGenes å forstå hvordan den output er formatert og se hvordan du skal velge utvalgskategorier å sammenligne ved å skrive (i R-terminal): ! anotaGetSigGenes </li><li> Filter og plotte gener som er ulikt oversatt. Det er flere terskler som kan brukes innenfor anotaPlotSigGenes funksjon og bruk av hjelpen vil forenkle en tilpasset kombinasjon av slike terskler. Hvis du vil velge for pålitelig analysert gener bruke minSlope (-0,5), maxSlope (1,5) og slopeP (0,01) innstillinger. Merk: I tillegg innstillinger som gjelder for RVM 23,26,30 falske funnraten (FDR) (0,15) og fold endringer (log2 [1,5]) kan f.eks brukes til å identifisere ulikt oversatt gener. Andre filtre som &quot;selDeltaPT&quot; kan være nyttig for en strengere filtrering (f.eks innstilling selDeltaPT til log2 [1,5]). Det er også nødvendig å spesifisere hvilke forhold bør filtreres (ved hjelp av selCont argument). Påfør de beskrevne innstillingene ved å legge til følgende linje i den myCode.Rfilen: anotaSigFiltered &lt;- anotaPlotSigGenes (anotaSigObj = anotaSigOut, selContr = 1, minSlope = (-0,5), maxSlope = 1,5, slopeP = 0,01, maxRvmPAdj = 0,15, minEff = log2 (1,5), selDeltaPT = log2 (1.5)) </li><li> Utføre analysen ved hjelp av kilden funksjon fra R-terminalen som beskrevet ovenfor. Dette vil også generere et grafisk utdata. Undersøke denne produksjonen er et godt utgangspunkt for å vurdere resultatene av analysen og identifisere eventuelle nødvendige endringer i innstillingene. </li><li> Generere en output tabellen. Legg til følgende kode i myCode.R filen: write.table (anotaSigFiltered $ selectedRvmData, file = &quot;MySignificantGenes.txt&quot;, sep = &quot; t&quot;) </li><li> Kjør koden ved hjelp av kildefunksjonen i R-terminalen. Kolonnene i den resulterende tabellen er forklart i hjelpen for anotaPlotSigGenes funksjonen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS Lett. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+regulons:+coordination+of+post-transcriptional+events.">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).</li><li>Komili, S., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+coordination+in+gene+expression+processes:+a+systems+biology+view.">Coupling and coordination in gene expression processes: a systems biology view.</a> Nat Rev Genet. 9, 38-48 (2008).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes:+mechanisms+and+biological+targets.">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136, 731-745 (2009).</li><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals.">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77, 731-758 (1997).</li><li>Johnson, L. F., Levis, R., Abelson, H. T., Green, H., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+RNA+in+relation+to+growth+of+the+fibroblast.+IV.+Alterations+in+theproduction+and+processing+of+mRNA+and+rRNA+in+resting+and+growing+cells.">Changes in RNA in relation to growth of the fibroblast. IV. Alterations in theproduction and processing of mRNA and rRNA in resting and growing cells.</a> J Cell Biol. 71, 933-938 (1976).</li><li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs.">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).</li><li>De Benedetti, A., Graff, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF-4E+expression+and+its+role+in+malignancies+and+metastases.">eIF-4E expression and its role in malignancies and metastases.</a> Oncogene. 23, 3189-3199 (2004).</li><li>Roux, P. P., Topisirovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+by+signaling+pathways.">Regulation of mRNA translation by signaling pathways.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Ron, D., Harding, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-folding+homeostasis+in+the+endoplasmic+reticulum+and+nutritional+regulation.">Protein-folding homeostasis in the endoplasmic reticulum and nutritional regulation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).</li><li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10, 254-266 (2010).</li><li>Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+Signalling+in+Health+and+Disease.">mTOR Signalling in Health and Disease.</a> Biochem Soc Trans. 39, 431-436 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+Translation+and+Energy+Metabolism+in+Cancer:+The+Role+of+the+MAPK+and+mTORC1+Pathways.">mRNA Translation and Energy Metabolism in Cancer: The Role of the MAPK and mTORC1 Pathways.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. , (2011).</li><li>Pavitt, G. D., Proud, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+and+its+control+in+neuronal+cells+with+a+focus+on+vanishing+white+matter+disease.">Protein synthesis and its control in neuronal cells with a focus on vanishing white matter disease.</a> Biochem Soc Trans. 37, 1298-1310 (2009).</li><li>Abe, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+and+neurodegeneration:+role+and+impact.">MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact.</a> Trends Cell Biol. 23, 30-36 (2013).</li><li>Kasinath, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+translation+in+renal+physiology+and+disease.">Regulation of mRNA translation in renal physiology and disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297, 1153-1165 (2009).</li><li>Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR:+from+growth+signal+integration+to+cancer,+diabetes+and+ageing.">mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 21-35 (2011).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (2013).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differential+translation+in+genome+wide+studies.">Identification of differential translation in genome wide studies.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Larsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+perturbation+of+the+translatome+by+the+antidiabetic+drug+metformin.">Distinct perturbation of the translatome by the antidiabetic drug metformin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8977-8982 (2012).</li><li>Colman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+host+mRNA+translation+during+hepatitis+C+virus+infection.">Genome-wide analysis of host mRNA translation during hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 87, 6668-6677 (2013).</li><li>Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=anota:+Analysis+of+differential+translation+in+genome-wide+studies.">anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies.</a> Bioinformatics. 27, 1440-1441 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+Newly+Synthesized+Polypeptides+by+Ribosome-Associated+RACK1/c-Jun+N-Terminal+Kinase/Eukaryotic+Elongation+Factor+1A2.">Degradation of Newly Synthesized Polypeptides by Ribosome-Associated RACK1/c-Jun N-Terminal Kinase/Eukaryotic Elongation Factor 1A2.</a> Complex. Mol Cell Biol. 33, 2510-2526 (2013).</li><li>Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiple+ribosomal+structure+in+protein+synthesis.">A multiple ribosomal structure in protein synthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 49, 122-129 (1963).</li><li>Gierer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+aggregated+reticulocyte+ribosomes+in+protein+synthesis.">Function of aggregated reticulocyte ribosomes in protein synthesis.</a> J Mol Biol. 6, 148-157 (1963).</li><li>Wright, G. W., Simon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+variance+model+for+detection+of+differential+gene+expression+in+small+microarray+experiments.">A random variance model for detection of differential gene expression in small microarray experiments.</a> Bioinformatics. 19, 2448-2455 (2003).</li><li>Eggers, D. K., Welch, W. J., Hansen, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexes+between+nascent+polypeptides+and+their+molecular+chaperones+in+the+cytosol+of+mammalian+cells.">Complexes between nascent polypeptides and their molecular chaperones in the cytosol of mammalian cells.</a> Mol Biol Cell. 8, 1559-1573 (1997).</li><li>Grosso, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCbetaII+modulates+translation+independently+from+mTOR+and+through+RACK1.">PKCbetaII modulates translation independently from mTOR and through RACK1.</a> Biochem J. 415, 77-85 (2008).</li><li>Oh, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC2+can+associate+with+ribosomes+to+promote+cotranslational+phosphorylation+and+stability+of+nascent+Akt+polypeptide.">mTORC2 can associate with ribosomes to promote cotranslational phosphorylation and stability of nascent Akt polypeptide.</a> EMBO J. 29, 3939-3951 (2010).</li><li>Zinzalla, V., Stracka, D., Oppliger, W., Hall, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC2+by+association+with+the+ribosome.">Activation of mTORC2 by association with the ribosome.</a> Cell. 144, 757-768 (2011).</li><li>Bjur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+translational+control+in+CD4++T+cell+subsets.">Distinct translational control in CD4+ T cell subsets.</a> PLoS Genet. 9, e13 (2013).</li><li>Leek, J. T., Storey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+heterogeneity+in+gene+expression+studies+by+surrogate+variable+analysis.">Capturing heterogeneity in gene expression studies by surrogate variable analysis.</a> PLoS Genet. 3, 1724-1735 (2007).</li><li>Guttman, M., Russell, P., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+Profiling+Provides+Evidence+that+Large+Noncoding+RNAs+Do+Not+Encode+Proteins.">Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins.</a> Cell. 154, 240-251 (2013).</li><li>Hsieh, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translational+landscape+of+mTOR+signalling+steers+cancer+initiation+and+metastasis.">The translational landscape of mTOR signalling steers cancer initiation and metastasis.</a> Nature. 485, 55-61 (2012).</li><li>Thoreen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485, 109-113 (2012).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Denne artikkelen beskriver et veletablert polysome fraksjone protokollen etterfulgt av et egenutviklet analysemetode for å fange kvalitative og kvantitative endringer i translasjonell aktivitet på et genom-bred skala i pattedyrceller. For vellykket gjennomføring av denne protokollen spesiell oppmerksomhet bør rettes mot en) Cell confluency (som spredning priser og næringsstoffer korrelerer med mRNA oversettelse aktivitet og kan påvirke sammensetningen av translatome, bør celle confluency være konsistente på tvers gjentak og eksperimentelle forhold), 2) Rapid cellelyse (Uavhengig tilstedeværelsen av cycloheximide og RNase hemmere i buffere, bør lyse være rask og cellulære ekstrakter bør legges over sakkarosegradienter umiddelbart etter lysering for å hindre RNA degradering og dissosiasjon av polysomes), 3) Gradient forberedelse (for å sikre høy data reproduserbarhet, bør sakkarosegradienter bli utarbeidet etter den gradient maker og spesielle forsiktighet bør utvises ved håndtering av dem). I tillegg til å studere endringene i translasjons-aktivitet, kan denne protokollen kan brukes for å isolere ribosom-assosiert protein-komplekser og etablere deres fysiologiske funksjoner. For dette formål kan nivåer og fosforylering statusen til forskjellige ribosom-assosiert protein bestemmes ved TCA nedbør, etterfulgt av Western blotting, mens ribosom-assosiert protein-komplekser kan immunoutfelt fra graderte fraksjoner og analysert ved Western blotting eller masse-spektrometri. En begrensning ved denne teknikken er at den langsomme gradient fraksjon metoden kan føre til dissosiasjon av enda tett bundne proteinene som har bindingskinetikken er i rask krets / dissosiasjon. Faktorer knyttet til nysyntetiserte polypeptider er typiske eksempler. Nylig syntetiserte polypeptider vekst danne ribosomene kan bli immobilisert på protein komplekser forbundet med ribosomer ved anvendelse av kjemiske tverrbindings eksempel 3, 3&#39;-ditiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Denne tilnærmingen avdekket at Receptor for Aktivert C Kinase 1 (RACK1) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / eukaryote oversettelse elongeringsfaktor 1A2 (eEF1A2) kompleks regulerer nedbrytning av nysyntetiserte polypeptider som svar på stress 27. I tillegg ble det tilsvarende metodikk som brukes i studier som viser at protein kinase C BII (PKCbII) er rekruttert til ribosomer etter RACK1 32 og at aktivering av mTOR kompleks 2 (mTORC2) skjer på ribosomene hvor det phosphorylates nysyntetiserte AKT polypeptider og regulerer deres stabilitet 33,34. Store begrensninger av polysome fraksjoneringsmetode etterfulgt av anota analyse er: 1) behovet for et relativt høyt antall celler (~ 15 x 10 6 celler), 2) mangel på posisjonsinformasjon vedrørende lokalisering av ribosomet på en gitt mRNA-molekylet, og 3 ) spørsmål knyttet til mobilnettet og molekylære heterohomogenitet av normale og tumorvev. Problemstillinger knyttet til nødvendig celle nummer kan løses ved å justere absorpsjonsspektra topper tilsvarende monosomes (80-tallet) av celler der beløpene er begrensende med de hentet fra høy overflod celler (f.eks HeLa-celler) 35. Ribosomet profilering teknikk (se nedenfor) kan brukes til å bestemme eksakt posisjonen av ribosomet på en gitt mRNA molekyl, mens samtidig andre problemer knyttet til virkninger av vev heterogenitet på tolkningen av endringer i genekspresjon fremstilt av komplekse systemer, for eksempel humane vev er diskutert i detalj i en publikasjon av Leek og Storey 36. Nylig ble en ny ribosom profilering teknikk utviklet, karakterisert ved at ribosomet beskyttede fragmenter (RPFs) er generert ved behandling RNAse I og analysert ved hjelp av dyp-sekvensering 22.. Denne teknikken tillater bestemmelse av ribosomet stilling ved et enkelt nukleotid-oppløsning, og dermed gi hittil unprecedented innsikt i ribosom biologi. For eksempel kan ribosom profilering anvendes for bestemmelse av ribosomet tettheten på en gitt mRNA molekyl eller identifisering av elementer som påvirker translation initiation priser som de alternative initiering områder, initiering ved ikke-august kodon og regulatoriske elementer som uORFs. Imidlertid er det flere metodiske begrensninger som begrenser muligheten for ribosomet profilering å nøyaktig beregne-mRNA-translasjonen effektivitet. Disse inkluderer uavhengige skjevheter introdusert av tilfeldige fragmentering og RNAse jeg fordøyelse, skjevheter introdusert av oversettings hemmere (f.eks tøyelighet hemmere som Emetine og cycloheximide er sannsynlig å indusere ribosom akkumulering ved oversettelse initiering nettsteder), et stort antall falske positive og falske negative resultater forbundet med TE score så vel som deres unøyaktighet i å forutsi den leser som kommer fra protein koding mRNA 37. Kanskje viktigst, mensribosom profilering tillater direkte identifisering av ribosom posisjon på en gitt mRNA molekyl, er antallet ribosomer som er forbundet med en gitt mRNA indirekte anslått ved å normalisere frekvenser av lyder i RPFs (ribosom-assosiert mRNA) over dem observert i tilfeldig fragmenterte mRNA (total mRNA). For eksempel vil i en enkel innstilling hvor fire &quot;B&quot;-mRNA-molekyler (Ba, Bb, BC og BD) er okkupert av fire ribosomer i stillingene 1, 2, 3 og 4, en iboende begrensning ved ribosomet profilering teknikk ikke tillate et skille mellom et scenario hvor alle 4 ribosomer forbinder bare med en Ba-mRNA i stillingene 1, 2, 3, og 4 og et scenario hvor Ba, Bb, Bc og Bd mRNA hver er opptatt av en enkelt ribosom i posisjon 1, 2 , 3 og 4, respektivt. I motsetning til dette i løpet av polysome fraksjonering, blir polysome integritet bevares, noe som gjorde at isolering av bassenger av mRNA forbundet med et definert antall ribosomer (fig. 1). Denne importenmaur skille mellom polysome fraksjonering og ribosom profilering antyder at mens den førstnevnte metode kan brukes til å direkte sammenligne mRNAs in mRNP, lette og tunge polysome fraksjoner, den sistnevnte metode vil sannsynligvis mislykkes i å fange opp endringer i translatome som er forårsaket av mRNA som overgang fra lett til tung polysomes, mens estimere bidraget av de som flytter fra mRNP brøk til tunge polysomes. Den biologiske betydningen av disse avvikene mellom de nevnte metodene er understreket av en stor mengde data som viser at translasjonsforskning aktivering av en undergruppe av mRNA som de som er eIF4E-sensitive, overgang fra lys til tunge polysomes, mens andre, slik som de skjuler 5&#39;TOP elementer, blir rekruttert til tunge polysomes direkte fra bassenger av ribosom-fri mRNA seks. Interessant nok har den mTOR veien vist seg å samtidig modulere oversettelsen av &quot;eIF4E-sensitive&quot; og 5&#39;TOP mRNA enEn. Derfor metodiske forskjeller som er omtalt ovenfor kan forklare den tilsynelatende uoverensstemmelse av konklusjonen mellom studier med ribosom profilering 38,39 og polysome fraksjone 24 for å vurdere effekten av mTOR-hemming på translatome. Som konklusjon, polysome fraksjonering og ribosom profilering er komplementære fremgangsmåter som i første rekke gir informasjon angående antallet ribosomer forbundet med mRNA og posisjonen til ribosomet på mRNA, respektivt. Viktigere, til tross for svakhetene og fordelene av disse metodene, er det fortsatt viktig at de genome-wide data innhentet av både prosedyrer er tilstrekkelig analysert og funksjonelt og biokjemisk validert.

De regulatoriske nettverk som styrer genuttrykk har blitt grundig studert i de siste to tiårene. De aller fleste av disse forskningsinnsats fokusert på transkripsjonsregulering, der endringer i steady-state mRNA nivåer på et genom-wide skala ble brukt til å bestemme såkalte &quot;genuttrykk&quot; profiler. Nyere studier viser at steady-state mRNA nivåer bare løst tilsvarer sammensetningen av proteomet 1,2, og dermed indikerer at de post-transcriptional mekanismer, inkludert mRNA oversettelse, spille en viktig rolle i regulering av genuttrykk 3,4. Faktisk har det vært anslått at ~ 50% av protein nivåer fastsettes på nivået av mRNA oversettelse i udødelig musefibroblaster fem. mRNA oversettelse er en svært regulert prosess der mRNA er oversatt til proteiner via orkestrert handling av ribosomer, transfer RNA (tRNAs) og tilbehørs faktorer commonly referert til som omregningsfaktorer (TFS) 6. Proteinsyntesen er den mest energikrevende prosess i pattedyrceller 7 og derfor globale mRNA omregningssatsene justeres for å imøtekomme celleproliferasjon priser åtte næringsstoffer og. I tillegg til endringer i globale mRNA oversettings priser, ulike ekstracellulære stimuli (f.eks hormoner og vekstfaktorer), intracellulære signaler (f.eks aminosyre nivåer) og ulike typer stress (f.eks ER-stress) induserer selektive endringer i bassengene av mRNA som er blir oversatt (translatome) 6. Avhengig av typen av stimuli, oversettelse aktivitet av noen, men ikke alle mRNA blir dramatisk påvirket, og derved resulterer i forandringer i proteomet som kreves for å montere en rask cellulær respons 6.. Disse kvalitative og kvantitative forandringer i translatome er antatt å bli mediert av samspillet mellom trans-virkende faktorer (f.eks </em&gt; komponenter av translasjonsforskning maskiner, hjelpe faktorer eller mirnas) og cis-elementer (RNA elementer eller funksjoner) som finnes i utvalgte undergrupper av mRNA 6,9. For eksempel endringer i nivåene og / eller aktivitet av hastighetsbegrensende oversettelse initiering faktorer eIF4E og eIF2 selektivt modulere oversettelse av vitnemål basert på de spesifikke 5&#39;UTR funksjoner seks. eIF4E og eIF2 er nødvendig for rekruttering av mRNA og initiator tRNA til ribosomet, henholdsvis seks. En økning i eIF4E aktivitet selektivt styrker oversettelse av mRNA skjuler lange og svært strukturerte 5&#39;UTRs inkludert de koding spredning og overlevelse stimulerende proteiner inkludert sykliner, c-myc og BCL-XL 10. I sin tur, inaktivering av eIF2 fører til en global proteinsyntese stansen, samtidig som selektivt opp regulere oversettelse av mRNA inneholdende korte inhiberende oppstrøms åpne leserammer (uORFs) i sine 5&#39;UTRs, slik som de som koder hoved transcriptional regulatorer av utbrettet protein respons (f.eks ATF4). I respons til forskjellige stimuli inkludert næringsstoffer, vekstfaktorer og hormoner, det mekanistiske / pattedyr målet for rapamycin (mTOR) pathway stimulerer eIF4E aktivitet ved å inaktivere 4E-bindende protein (4E-BP) familie av oversettingsdempere, mens MAPK veien fosforylerer direkte eIF4E 6,11. I sin tur, eIF2α kinaser (dvs. perk, PKR, HRI og GCN2) hemme eIF2 ved fosforylerende sin eIF2α regulerende subenhet som svar på næringsmangel, ER-stress og virus infeksjon 6,12. Endringer i aktiviteten og / eller ekspresjon av TFS, har andre komponenter i maskiner og translasjonelle regulatoriske faktorer, inkludert miRNAs blitt observert i forskjellige patologiske tilstander inkludert kreft, metabolsk syndrom, nevrologiske og psykiatriske lidelser, og nyre-og hjerte-karsykdommer 13-19. Sammen er disse dataene indikerer at translasjonell megchanisms spille en sentral rolle i å opprettholde celle homeostase og at deres opphevelse spiller en sentral rolle i etiologien av ulike menneskelige sykdommer. Heri er en protokoll for fraksjonering av polysomes med sukrose-densitets-gradient sentrifugering i pattedyrceller, som anvendes for å skille polysomes fra monosomes, ribosomale subenheter og messenger ribonucleoprotein partikler (mRNPs) er beskrevet. Dette gjør at diskriminering mellom effektivt oversatt (assosiert med tunge polysomes) fra dårlig oversatt (assosiert med lys polysomes) mRNA. I denne analysen blir ribosomer immobilisert på mRNA ved hjelp av oversettelsesforlengelses hemmere som cykloheksimid 20 og cytosoliske ekstrakter blir separert på 5-50% lineær sukrose densitetsgradienter ved ultrasentrifugering. Etterfølgende fraksjonering av sakkarosegradienter tillater isolering av mRNA i henhold til antallet av ribosomer de binder seg til. RNA ble ekstrahert fra hver fraksjon kan deretter brukes til å bestemmeendringer i fordelingen av mRNA over gradient mellom forskjellige forhold, hvorved translasjonelle effektivitet øker fra toppen til bunnen av gradienten. Northern blotting eller kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) benyttes for å bestemme nivået av mRNA i hver fraksjon. Alternativt, er fraksjoner som inneholder tung polysomes (vanligvis mer enn tre ribosomer) samles og genome-wide polysome-assosiert mRNA nivåer er fastsatt ved bruk av microarray eller dyp-sekvensering. Det er av største viktighet å understreke at nivåene av polysome-forbundet mRNA er, i tillegg til oversettelse, påvirket av transkripsjons og post-transcriptional mekanismer som påvirker cytosoliske mRNA nivåer 21. Derfor, for å bestemme forskjeller i oversettelse ved hjelp av genomdata fra polysome-assosiert mRNA er det nødvendig å korrigere for effektene av trinnene i genekspresjon bane som er oppstrøms for omregsjon 21. Å tillate en slik korreksjon, er cytosolic RNA utarbeidet parallelt med polysome-assosiert RNA fra hver prøve, og de ​​genome-wide steady-state mRNA nivåer fastsettes 21. Foreløpig såkalt &quot;oversettelse effektivitet&quot; (TE) score (dvs. log-ratio mellom polysome-assosiert mRNA data og cytosoliske mRNA data) blir ofte brukt til å korrigere for effekten av endringer i cytosoliske mRNA nivåer på oversettelses effektiviteten av en gitt mRNA 22. Imidlertid, ved hjelp av TE-score for å identifisere differensial oversettelsen er forbundet med et betydelig antall falske positive og falske negative resultater på grunn av en matematisk egenskap for TE resultatet ofte referert til som falsk korrelasjon 27.. Faktisk en undersøkelse av datasett fra flere laboratorier indikerte at slike falske sammenhenger synes å være uunngåelig når analysere endringer i translatomes 23. Dette fikk utviklingen av &quot;analyse av differensial tr<html> anslation &quot;(anota) algoritme, som ikke lider av de nevnte svakheter 23. Under anota-analyse en regresjon modellen brukes til å utlede tiltak av translasjonell aktivitet uavhengig av cytosoliske RNA nivåer. Slike tiltak blir så sammenlignet mellom forhold og en statistikk beregnes. Brukeren har muligheten til å bruke en varians krymping metoden, som forbedrer statistisk styrke og reduserer forekomsten av falske positive funn i studier med få replikater 24. Betydelig, ble det nylig vist at forstyrrelsene i translatome fanget av anota, men ikke TE score, korrelerer med endringer i proteomet 25. Derfor er det sterkt anbefalt å bruke anota analyse for identifisering av endringer i oversettelse på et genom-wide skala. Mens de teoretiske fundamentet for den anota algoritmen ble diskutert i detalj tidligere 21,23,26, her er fokus på hvordan å bruke den i praksis. ve_content &quot;&gt; I tillegg til å studere endringer i mRNA oversettelse aktivitet i cellen, kan dette ribosom fraksjone protokollen brukes til å isolere og biokjemisk og funksjonelt karakter ribosom-og polysome-assosiert protein komplekser. Denne tilnærmingen har med hell vært utplassert i det siste til å identifisere komplekser som regulerer stabiliteten av nylig syntetiserte polypeptider 27 og / eller er involvert i fosforyleringen av komponentene i den translasjonelle maskiner. Denne anvendelsen av polysome fraksjoneringsmetode vil også bli kort omtalt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">HB0264</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MgCl 2</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">KCl</td>
			<td style="width:84px;">VWR</td>
			<td>CABDH4532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">DB0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Tris</td>
			<td style="width:84px;">Biobasic</td>
			<td style="width:119px;">TB0196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glycoblue</td>
			<td style="width:84px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9515</td>
			<td>RNA precipitation carrier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Deoxycholate&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">04693132001</td>
			<td>Tablets (EDTA-free)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">0.45 &#181;m Filter System 150 ml</td>
			<td style="width:84px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sucrose</td>
			<td style="width:84px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">RNeasy MinElute Cleanup kit&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74204</td>
			<td>RNA cleanup kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Equipments</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">SW41Ti Rotor Package with accessories</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Optima L100 XP ultra centrifuge</td>
			<td style="width:84px;">Beckman Coulter</td>
			<td>DS-9340A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">ISCO fraction collector&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FC-176-R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Type II Detector with Chart Recorder</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">UA-6</td>
			<td>UV detector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">BR-A86-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UA-6 Detector Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">60-1020-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">FC-176 Communication Cable</td>
			<td style="width:84px;">Brandel</td>
			<td style="width:119px;">FCC-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Master Base Unit</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">108-1</td>
			<td>Gradient Maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Gradient Forming Attachments</td>
			<td style="width:84px;">Biocomp</td>
			<td style="width:119px;">105-914A-1R</td>
			<td>Gradient Maker attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">USB-1208FS</td>
			<td>Analysis software attachment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Measurement Computing Data Acquisition Software</td>
			<td style="width:84px;">MicroDAQ</td>
			<td style="width:119px;">TracerDAQ Pro</td>
			<td>Analysis software (Download only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Buffers</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">10X buffer for sucrose gradients:</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM HEPES (pH7.6)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M KCl</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 &#181;g/ml cycloheximide</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 units/ml RNase inhibitor</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;"></td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mM Tris-HCl (pH7.5)</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">2.5 mM MgCl2</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 mM KCl&#160;</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)]</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:269px;">Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text</td>
			<td style="width:84px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale

mRNA oversettelses spiller en sentral rolle i reguleringen av genekspresjon, og representerer den mest energikrevende prosess i pattedyrceller. Følgelig blir feilregulering av mRNA oversettelses anses å spille en viktig rolle i en rekke patologiske tilstander, inkludert kreft. Ribosomer også vert anstand, som letter folding av begynnende polypeptider, dermed modulerende funksjon og stabilitet nysyntetiserte polypeptider. I tillegg er nye data indikerer at ribosomer tjene som en plattform for et repertoar av signalmolekyler, som er implisert i en rekke post-translasjonelle modifikasjoner av nylig syntetiserte polypeptider som de kommer fra ribosomet, og / eller komponenter av translasjons-maskineri. Heri er en veletablert metode for ribosom fraksjonering ved hjelp av sucrose-densitets-gradient sentrifugering er beskrevet. I forbindelse med den egenutviklede &quot;anota&quot; algoritmen denne metoden tillater direkte bestemmelse av forskjellerrential oversettelse av individuelle mRNA på et genom-wide skala. Videre kan denne allsidige protokollen brukes til en rekke biokjemiske studier tar sikte på å dissekere funksjonen av ribosom-assosiert protein komplekser, inkludert de som spiller en sentral rolle i folding og degradering av nysyntetiserte polypeptider.

mTOR er en viktig node i mobilnettet som koordinerer globale protein syntese priser med næringsstoffer 19. mRNA oversettelses reguleres i hovedsak ved det hastighetsbegrensende trinn 6 initiering. Andelen av ribosomer engasjert i polysomes positivt korrelerer med oversettelse initiering priser 28. Et eksempel på anvendelse av polysome fraksjoneringsmetode for å undersøke rollen til mTOR-signalisering i å mediere virkningene av insulin på mRNA oversettelsen er presentert. For dette formål ble MCF7 humane brystcancer-celler opprettholdt i lav serum og deretter stimulert med insulin alene eller i kombinasjon med det aktive stedet mTOR inhibitor Torin1. Ikke-stimulerte celler som ble kontinuerlig holdt i lave serum, tjente som en kontroll. mRNPs, monosome (80S) og polysome fraksjonene ble separert ved hjelp av polysome fraksjone metoden. I forhold til kontrollceller indusert insulin en økning i absorbans i graderte fraksjoner svarendetil polysomes, ledsaget av en samtidig reduksjon i absorbans i monosome fraksjon (fig. 1). Disse funnene viser at andelen av ribosomer som driver polysomes økes i insulin ble behandlet i forhold til kontrollcellene, dermed indikerer at, som forventet, stimulerer insulin globale translation initiation priser. Torin1 reverseres effekten av insulin på absorbans-profiler (fig. 1), for derved som bekrefter de funn som mTOR signalering spiller en viktig rolle som formidler effekten av insulin på omregningen maskiner 19.. Med utgangspunkt i en grunnsetning at uoverensstemmelser i gradient preparat ikke kan unngås, er blitt reist spørsmål med hensyn til reproduserbarheten av de data som oppnås ved hjelp av polysome fraksjoneringsmetoden 22.. For å teste empirisk dette potensielt skadelig problemet, cytosoliske og tung polysome-assosiert RNA (mRNA assosiert med fire og flere ribosomer) var isolert<html> fra MCF7-celler behandlet med insulin alene eller i kombinasjon med insulin Torin1 fra fire uavhengige biologiske replikater (figur 2). Virkningene av insulin og Torin1 på sammensetningen av cytosolisk og tunge polysome-assosiert mRNA i hvert replikat ble bestemt på et genom målestokk ved hjelp av en mikromatrisemetoden. For å bestemme reproduserbarheten av polysome fraksjoneringsmetoden hovedkomponentanalyse (PCA) ble anvendt. Slik analyse viste at prøvene som tilhører hver betingelse ble tett posisjonert innenfor de første to komponentene, mens de andre betingelser var godt adskilt (fig. 2). Disse funnene viser at polysome fraksjone metoden som er beskrevet her er svært reproduserbare og derfor hensiktsmessig å studere kvantitative og kvalitative endringer i oversettelse på et genom-wide nivå. ad/51455/51455fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1. Polysomal profiler som viser effektene av serum sult, insulin og mTOR signale på global oversettelse i MCF7 celler. MCF7 celler ble fratatt næringsstoffer (vedlikeholdt i 0,1% FBS) for 16 timer og behandlet med 5 nM insulin (INS) alene eller i kombinasjon med 250 nM Torin1 (Ins + Torin1) i 4 timer. Ubehandlede celler som ble kontinuerlig berøvet næringsstoffer (0,1% FBS) ble anvendt som en kontroll. De tilsvarende cytosoliske ekstrakter ble sedimentert ved sentrifugering på 5-50% sakkarosegradienter. Gratis ribosomal subenheter (40S og 60S), monosomes (80-tallet) og antall ribosomer i polysome fraksjoner indikeres. <img alt="Fig. 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" /> Figur 2. Genome-wide data innhentet ved bruk av polysome profilering er reproduserbar. MCF7-celler ble behandlet som i figur 1.. cytosol og polysome-assosiert RNA (&gt; 3 ribosomer) ble ekstrahert fra fire uavhengige biologiske replikater og deres genom mRNA-nivåer ble bestemt ved anvendelse av GeneTitan arrays (Affymetrix). PCA ble brukt for å vurdere reproduserbarheten av de resulterende data. Vist er de to første PCA-komponenter for alle behandlinger (T1 = Torin 1; ctrl = kontroll; Ins = insulin), opprinnelse av RNA (C = cytosolic, P = polysome-forbundet) og gjentak. Prøver fra samme stand og RNA opprinnelse er tett plassert indikerer høy reproduserbarhet.

Watch this Scientific Journal Video about Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale at JoVE.com

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Ribosomer spille en sentral rolle i proteinsyntesen. Polyribosome (polysome) fraksjonering av sukrose tettshetsgradient sentrifuge tillater direkte bestemmelse av omregnings effektiviteten av individuelle mRNA på et genom-wide skala. I tillegg kan denne fremgangsmåte benyttes for biokjemisk analyse av ribosom-og polysome-assosierte faktorer som anstand og signalmolekyler.

Polysome fraksjonering og analyse av pattedyr Translatomes på en Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Research

JoVE Journal

Biology

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

Scale-Up av pattedyrceller Kultur bruke en ny flere lag Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

Analyse av Cell Cycle Posisjon i pattedyrceller

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesiansk Change-point algoritme for Genome-wide analyse av Diverse ChIPseq Datatyper

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Analyse av Oversettelse Innvielse Under stressbetingelser ved Polysome Profilering

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...